一种i型胶原蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物高分子技术领域，特别的设及一种I型胶原蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最 多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25%~30%。与组织的形成、成熟、细胞间信息 的传递，W及关节润滑、伤口愈合、巧化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系。胶原蛋白 也是生物科技产业最具关键性的原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业等均有着广泛 应用。
[000引I型胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性W及生物活性，比如低抗原 性、在体内易被人体吸收、能促进细胞成活与生长、促进血小板凝结等在食品、医药、组织工 程、化妆品等领域获得广泛的应用。
[0004] 目前I型胶原蛋白提取主要有酶法，酸法，碱法，然后将氯化钢固体加入到胶原蛋 白粗溶液中，静置等待胶原蛋白固体析出，收集胶原蛋白固体再溶解，透析，得I型胶原蛋 白；采用目前胶原蛋白盐析的方法，制备所得胶原蛋白不但含杂质量高，纯度低，而且在制 备过程中后处理时间长，步骤繁琐，试剂用量大，产品收率低。
[0005] 鉴于W上，现有技术中缺少一种优良的制备I型胶原蛋白的方法，能够提高产品 纯度和收率，保证产品质量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种I型胶原蛋白的制备方法，具 体步骤简单，操作简便，产品收率高和纯度高的特点。
[0007] 本发明人考虑到I型胶原蛋白的良好市场前景，一直致力于寻找一种优良的制备 I行胶原蛋白的方法。现在传统的方法是将化Cl固体加入胶原蛋白粗溶液中，使胶原蛋白 析出，用此方法胶原蛋白会在化Cl加入的瞬间大量析出，析出的胶原中会包裹大量的未溶 解的化Cl,同时随着胶原蛋白的大量析出，会有一些杂蛋白和脂类物质夹带在其中。考虑到 胶原蛋白是一种两性电解质，在等电点附近会析出，脂类物质易溶于有机溶剂，如果能使胶 原蛋白粗溶液逐滴析出，滴加到含有饱和NaCl的溶液中，不仅可W降低胶原蛋白析出时对 杂蛋白的夹带析出，还可W由于有机溶剂的存在，降低脂类物质的含量。发明人考虑所有影 响因素后，经过不断的试验和创造得到了本发明的技术方案，具体而言： 本发明提供了一种I型胶原蛋白的制备方法，该方法包括：将经酶解离屯、后的胶原蛋 白粗溶液和氨氧化钢溶液同时滴加到饱和氯化钢的混合溶液中，再经离屯、分离得到I型胶 原蛋白固体，所述混合溶液为亲水性有机溶剂和水的混合液。
[0008] 作为本发明进一步的改进，所述亲水性有机溶剂选自甲醇、乙醇或丙酬，优选的为 乙醇。
[0009] 作为本发明进一步的改进，所述混合溶液中亲水性有机溶剂的含量10%-60%。
[0010] 作为本发明进一步的改进，所述氨氧化钢溶液的浓度为0. 01-0. 2mol/L。
[0011] 作为本发明进一步的改进，所述氨氧化钢溶液的加入量为控制I型胶原蛋白析出 时的环境体系中抑值为4. 7~5. 0。
[0012] 作为本发明进一步的改进，所述胶原蛋白粗溶液和饱和氯化钢的混合溶液的体积 比为5 :1~1 :1。
[0013] 作为本发明进一步的改进，具体包括如下步骤： (1) 向饱和氯化钢的混合溶液中，同时滴加氨氧化钢溶液和经酶解离屯、后的胶原粗溶 液，控制抑=4. 7~5. 0,胶原固体析出； (2) 对步骤（1)得到的胶原固体进行离屯、得到胶原粗品，然后用醋酸溶液溶解，透析， 即得。
[0014] 与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下： 本发明所提供的制备方法利用在胶原蛋白等电点，通过同时加入胶原蛋白粗溶液和碱 液控制抑值，使胶原蛋白固体在饱和氯化钢溶液中沉淀，由于盐析溶液中存在乙醇，可W 溶解一些只经过盐析无法去除的杂质，如脂类，提高胶原蛋白纯度；同时可W减少氯化钢用 量，解决胶原析出过程中包裹大量氯化钢的问题，使后期水洗步骤简化，纯化水用量减少。
[0015] 本发明所提供的方法使胶原蛋白固体析出更充分，可W使产品收率达到15-20%; 纯度得到提高，同时操作更加简单，缩短了反应处理时间。
【具体实施方式】
[0016]W下结合具体实施例对本发明进行进一步详细的叙述。
[0017] 实施例1胶原蛋白粗溶液的制备 在2000ml的反应瓶中加入20g牛跟腫，500ml0. 5mol/L的醋酸溶液，50mg胃蛋白酶， 0~10乂揽拌反应2地，加入500ml0. 5mol/L的醋酸溶液，揽拌均匀离屯、取上清，得胶原蛋白 粗溶液。
[0018] 实施例2I型胶原蛋的制备 在5000ml的烧杯中加入2000ml饱和氯化钢的乙醇水混合溶液，所述的乙醇水混合溶 液中乙醇的含量为30%，向溶液中同时滴加0. 05mol/L的氨氧化钢溶液和2000ml实施例1 得到的胶原粗溶液，控制抑=4. 7~5. 0,胶原固体析出，离屯、，固体用纯化水洗涂S次，每次纯 化水用量为100ml，离屯、得胶原粗品，然后用0. 5mol/L醋酸溶液溶解，透析，即得216g胶原 蛋白溶液，测干重，收率16%，纯度99. 5%，脂质体0. 2%。
[0019] 实施例3I型胶原蛋的制备 在1000 Oml的烧杯中加入1000 ml饱和氯化钢的乙醇水混合溶液，所述的乙醇水混合溶 液中乙醇的含量为60%，向溶液中同时滴加0.Olmol/L的氨氧化钢溶液和5000ml实施例1 得到的胶原蛋白粗溶液，控制抑=4. 7~5. 0,胶原固体析出，离屯、，固体用纯化水洗涂S次，每 次纯化水用量为100ml，离屯、得胶原粗品，然后用0. 5mol醋酸溶液溶解，透析，即得243g胶 原蛋白溶液，测干重，收率18%，纯度99. 9%，脂质体0. 05%。
[0020] 实施例4I型胶原蛋的制备 在5000ml的烧杯中加入2000ml饱和氯化钢丙酬水混合溶液，所述丙酬水混合溶液中 丙酬的含量为10%，向溶液中同时滴加0.Imol/L氨氧化钢溶液和实施例1得到的胶原粗 溶液，控制抑=4. 7~5. 0,胶原固体析出，离屯、，固体用纯化水洗涂S次，每次纯化水用量为100mL，离屯、得胶原粗品，然后用0. 5mol醋酸溶液溶解，透析，即得270g胶原蛋白溶液，测干 重，收率20%，纯度99. 2%，脂质体0. 1%。
[00川对比例1 在5000ml的烧杯中加入1000 ml饱和氯化钢的乙醇水混合溶液，所述的乙醇水混合溶 液中乙醇的含量为60%，向溶液加入实施例1得到的胶原蛋白粗溶液，放置24~4她，胶原固 体析出，离屯、，固体用纯化水洗涂S次，每次纯化水用量为100ml，离屯、得胶原粗品，然后用 0. 5mol醋酸溶液溶解，透析，即得125g胶原蛋白溶液，测干重，收率9. 3%，纯度97%，脂质体 20/0。
[002引对比例2 在5000ml的烧杯中加入1000 ml饱和氯化钢水溶液，向溶液中同时滴加0.Olmol/L的 氨氧化钢溶液和实施例1得到的胶原蛋白粗溶液，控制抑=4. 7~5. 0,胶原固体析出，离屯、， 固体用纯化水洗涂S次，每次纯化水用量为100ml，离屯、得胶原粗品，然后用0. 5mol醋酸溶 液溶解，透析，即得190g胶原蛋白溶液，测干重，收率14%，纯度95%，脂质体3%。
[0023] 对比例3 在5000ml的烧杯中加入1000 ml乙醇水混合溶液，所述的乙醇水混合溶液中乙醇的含 量为60%，向溶液中同时滴加0.Olmol/L的氨氧化钢溶液和实施例1得到的胶原蛋白粗 溶液，控制抑=4. 7~5. 0,胶原固体析出，离屯、，固体用纯化水洗涂S次，每次纯化水用量为 100ml，离屯、得胶原粗品，然后用0. 5mol醋酸溶液溶解，透析，即得170g胶原蛋白溶液，测干 重，收率12. 5%，纯度98%，脂质体1%。
[0024] 对比例4 在5000ml的烧杯中加入胶原蛋白粗溶液，然后加入1000 ml饱和氯化钢的乙醇水混合 溶液，所述的乙醇水混合溶液中乙醇的含量为60%，然后滴加0.Olmol/L的氨氧化钢溶液， 调至抑=4. 7~5. 0,胶原固体析出，离屯、，固体用纯化水洗涂S次，每次纯化水用量为100ml， 离屯、得胶原粗品，然后用0. 5mol醋酸溶液溶解，透析，即得182g胶原蛋白溶液，测干重，收 率13. 5%，纯度97%，脂质体2%。
[00巧]试验例1对饱和氯化钢的乙醇水混合溶液的考察 在5000ml的烧杯中加入1000 ml饱和氯化钢的乙醇水混合溶液，所述的乙醇水混合溶 液中乙醇的含量见表1，向溶液中同时滴加表1浓度的氨氧化钢溶液和实施例1得到的胶 原蛋白粗溶液，控制抑=4. 7~5. 0,胶原固体析出，离屯、，固体用纯化水洗涂S次，每次纯化水 用量为100ml，离屯、得胶原粗品，然后用0. 5mol醋酸溶液溶解，透析，得到的产品的收率P、 纯度A和脂质体含量山，见表1。
[0026]W上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对 于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而 易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
【主权项】
1. 一种I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，将经酶解离心后的胶原蛋白粗溶液和 氢氧化钠溶液同时滴加到饱和氯化钠的混合溶液中，再经离心分离得到I型胶原蛋白固 体，所述混合溶液为亲水性有机溶剂和水的混合液。2. 根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述亲水性有机 溶剂选自甲醇、乙醇或丙酮。3. 根据权利要求1或2所述的一种I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述混合溶 液中亲水性有机溶剂的含量10%_60%。4. 根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶 液的浓度为〇? 01-0. 2mol/L〇5. 根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶 液的加入量为控制I型胶原蛋白析出时的环境体系中pH值为4. 7~5. 0。6. 根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白粗 溶液和饱和氯化钠的混合溶液的体积比为5 :1~1 :1。7. 根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，具体包括如下步 骤： (1) 向饱和氯化钠的混合溶液中，同时滴加氢氧化钠溶液和经酶解离心后的胶原粗溶 液，控制pH值为4. 7~5. 0,胶原固体析出； (2) 对步骤（1)得到的胶原固体进行离心得到胶原粗品，然后用醋酸溶液溶解，透析， 即得。
【专利摘要】本发明涉及一种I型胶原蛋白的制备方法，该方法包括：将经酶解离心后的胶原蛋白粗溶液和氢氧化钠溶液同时滴加到饱和氯化钠的混合溶液中，再经离心分离得到I型胶原蛋白固体，所述混合溶液为亲水性有机溶剂和水的混合液。本发明所提供的方法使胶原蛋白固体析出更充分，可以使产品收率达到15-20%；纯度得到提高，同时操作更加简单，缩短了反应处理时间。
【IPC分类】C07K14/78, C07K1/30
【公开号】CN105218663
【申请号】CN201510699591
【发明人】齐磊, 王静芬, 樊春媛, 李 杰, 郭海云
【申请人】河北柯瑞生物医药有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月26日