可避免假阴性的手足口病毒CoxA16恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法
【专利说明】可避免假阴性的手足口病毒CoxA16恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及手足口病毒CoxAie的恒温检测引物组、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0003]手足口病是一种全球性传染病，大部分国家和地区历年来都有该病流行的报道。其主要是由肠道病毒引起的常见传染病，主要通过粪口途径和密切接触等方式传播。据流行病学调查显示5岁以下的儿童是该病发病的高危人群，占发病总数的90%以上，其中3岁以下婴幼儿是重症发病的高危人群，成人感染患病几率极低。手足口病疫区分布广泛，没有严格的地区性，全球各地均有疫情爆发。手足口病在热带地区四季均可发病，在亚热带、温带地区以夏季为主，冬季的发病较为少见。根据国内外相关文献报道，能引起手足口病的肠道病毒种类很多，其中最主要的是肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇A16型(CoxA16)。
[0004]手足口病毒CoxA16属于细小RNA病毒科肠道病毒A组(HEVA)，该病毒无包膜，病毒颗粒为二十面体了立体对称的球形结构，直径约为23-30 nm ;基因组为单股正链RNA，衣壳由60个亚单位组成，后者由VP1、VP2、VP3、VP4四种外壳蛋白拼装成五聚体结构，VPl或3’ -VPl区是其基因分型和进化分析最常用的区域。CoxAie感染一般不会引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种中枢系统相关的疾病，但可能会引起心肌炎、心肌病以及呼吸道感染、结膜炎、发热性皮疹、疱疹性咽颊炎、急性弛缓性麻痹等疾病。因此CoxA16作为手足口病的另一重要的病原体也应予以一定的重视。
[0005]肠道病毒鉴定的基本方法是使用血清型特异性的中和抗血清进行的中和实验。但是这种方法由于要进行细胞培养、病毒分离以及血清中和等实验，所以其流程费时、操作繁琐、且敏感性、检出率偏低。补体结合实验和酶联免疫吸附实验是手足口病免疫学检测的常用方法，但前者在检测中假阳性偏高；后者因为肠道病毒血清型多而不能涵盖所有常见肠道病毒的型别。
[0006]以核酸为基础的PCR技术及恒温扩增技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于手足口病毒CoxAie检测。但检测样品复杂，因目前检测方法对假阴性的检测结果没有采取监控手段，故存在漏检的可能，但手足口病毒CoxAie危害严重，漏检造成的危害无法估量，此外，PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种可鉴别假阴性检测结果的快速、高通量且对仪器要求不高的手足口病毒CoxAie检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。恒温扩增技术具有检测时间短，易于操作等优点，本发明在恒温扩增技术基础上加入内标基因，可提供一种有效鉴别检测结果为假阴性检测方法，有利于手足口病毒CoxAie的准确、及时发现，更加有利于恒温检测方法在检测中的推广应用及提高检测的准确度。
[0007]本发明在样品管检测的时候同时设立一个内标基因检测管，该内标检测管及检测方法具有以下特点:1)内标基因与实际样品的检测不在同一管中进行检测，2)该内标基因的扩增靶标与样品检测管中的扩增靶标不同，3)内标基因的扩增靶标的核酸浓度在该内标基因的检测线附近，可识别轻微的反应抑制。正常情况下因内标检测管在加入样品提取液的同时加入有低浓度的内标靶标片段，所以内标检测管检测检测结果为阳性，如内标管检测结果为阴性，提示样品提取液中含有抑制因子或其他原因，导致内标检测管不能进行扩增反应，同样样品检测管也可能因抑制因子或其他原因导致不能进行正常扩增检测，造成样品检测管检测结果为假阴性，因此该方法可根据内标管的检测结果辅助判断样品检测结果可能为假阴性结果。
【发明内容】
[0008]本发明的一个目的在于提供一种用于检测手足口病毒CoxAie的反转录恒温荧光引物组合物。
[0009]本发明的另一个目的在于提供一种手足口病毒CoxAie的反转录恒温荧光检测试剂盒。
[0010]本发明的另一个目的在于提供一种手足口病毒CoxAie的反转录恒温荧光检测方法。
[0011]本发明所采取的技术方案是:
用于检测手足口病毒CoxAie的反转录恒温荧光检测引物组合物，其包含一组检测引物和一组内标引物，其中，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
CAA-F3:5’ -AATGCTAGTGACAAGAATCTCA-3’ ；
CAA-B3:5’ -GTTTGGCTACGACAAATGTG-3’ ；
CAA-FIP:5’ -AAACCGGCACGGCTAAAGAAGTGTTGAACCATCACTCCA-3’ ；
CAA-BIP:5’ -AGCATCATTACAATGCCCACCAATATCCCATCAAGTCAATGTCC-3’ ；
CAA-LF:5’ -ATTCCCAATGGCTGTCTCC-3’ ；
CAA-LB:5， -GGTACACAGAACACAGATGGT-3，。
[0012]所述内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
CAB-F3:5’ -GTTGAGTACATTGTCAGGTCA-3’ ；
CAB-B3:5’ -CTAGCAGCCGTTGGTATC-3’ ；
CAB-FIP:5’ -GGGTCATGGTCGGGTATTCGGCACGAGACGACATTCTT-3’ ；
CAB-BIP:5’ -TTGAGTGTTGCTCCCGACGTCACTTGTGCGTTACGAC-3’ ；
CAB-LoopF:5’ -TTATCGACCGCAGTGACTG-3’ ；
CAB-LoopB:5’ -GGACAGGTAGTCACCGTTG-3’。
[0013]一种手足口病毒CoxAie的恒温荧光检测试剂盒，检测试剂盒包括如上所述的检测引物组和内标引物组。
[0014]作为优选的，所述检测引物组及内标引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为:1_2:4_8:2_4。
[0015]作为优选的，所述的手足口病毒CoxAie的恒温荧光检测试剂盒中还包括以下成分:(I)反应液；(2 ) DNA聚合酶；(3 ) RNA反转录酶；(4)内标靶标片段；(5 )阳性对照和阴性对照。
[0016]作为优选的，所述DNA聚合酶为feiDNA聚合酶。
[0017]作为优选的，所述RNA反转录酶为转录酶。
[0018]作为优选的，所述反应液含有:6mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液、三者的体积比是7:4:3。
[0019]作为优选的，所述阳性对照为含有手足口病毒CoxAie CAA基因片段的T载体克隆，阴性对照为超纯水，内标靶标片段为含有手足口病毒CoxAie CAB基因片段的T载体克隆。
[0020]一种手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测方法，包括如下步骤:
(1)待检样品RNA的提取:采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA;
(2)利用权利要求1的恒温荧光检测引物组合物对待检样品RNA进行反转录恒温扩增；
(3)结果判断:将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据CAA基因检测结果和内标基因CAB检测结果进行判断:
CAA基因检测结果为阳性内标基因CAB检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
CAA基因检测结果为阴性内标基因CAB检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；
CAA基因检测结果为阳性内标基因CAB检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
CAA基因检测结果为阴性内标基因CAB检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取RNA进行检测。
[0021 ]恒温扩增的 25 μ I 反应体系含有:CAA-F3 0.2 μ M，CAA-B3 0.2 μ M，CAA-FIP1.6 μ Μ，CAA-BIP 1.6 μ Μ，CAA-LF 0.8 μ Μ, CAA-LB 0.8 μ Μ，CAB-F3 0.2 μ Μ，CAB-B30.2 μ Μ，CAB-FIP 1.6 μ Μ，CAB-BIP 1.6 μ Μ，CAB-LoopF 0.8 μ Μ，CAB-LoopB 0.8 μ Μ，反应液12.5 μ l，feiDNA聚合酶8U，版转录酶0.8 U，10X SYBR Green I 0.5 μ 1，待检样品 2 μ I，内标2 μ 1，用超纯水补