鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探针、以及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，特别是指一种鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和 探针、W及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 非结核分枝杆菌广泛存在于自然界的±壤，尘埃，水，鱼类和家禽中，传播途径主 要从环境中获得感染，例如污水，而人与人之间的传染极少见。通常此类分枝杆菌对人类致 病性较结核分枝杆菌低，但如果存在易感因素，使宿主局部或全身免疫功能发生障碍，则可 导致病变。非结核分枝杆菌其中W鸟胞内分枝杆菌复合群（Maviumcomplex)堪萨斯分枝 杆菌（M.Kartsasii)和赡餘分枝杆菌（M.xenopi)为引起肺部病变的最常见致病菌。
[0003] 鸟分枝杆菌病是由鸟-胞内分枝杆菌复合体（Mycobacteriumaviumcomplex或My cobacteriumavium-intracellularecomplex,MAIC)感染引起的人兽共患性传染病。MAIC 感染后可侵害多种组织器官包括肺、骨髓和淋己结等。临床病症主要包括单一的结节、结节 状的支气管扩张、结节样的浸润和在免疫力低下患者中的扩散性浸润四种类型。
[0004] 目前，实验室里鉴定分枝杆菌采用的方法为涂片法和培养法。涂片法不能将结核 分枝杆菌和非结核分枝杆菌分开；培养法准确但需要培养2-3次才能确认，且耗时过长。近 些年来也出现了一些针对鸟胞内分枝杆菌复合群的分子生物学鉴定方法，但也均需4-6个 小时，如反向杂交，PCR-RFLP等，且容易出现实验室污染。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提出一种鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探 针、W及其检测方法。
[0006] 基于上述目的本发明提供的用于检测鸟胞内分枝杆菌复合群的引物，包括用于检 测鸟分枝杆菌的上游引物和下游引物，其核巧酸序列分别为序列表中的SEQIDNO. 1和SEQ IDNO. 2 ;W及用于检测胞内分枝杆菌的上游引物和下游引物，其核巧酸序列分别为序列表 中的沈QIDNO. 3和沈QIDNO. 4。
[0007] 由上述引物衍生的引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ IDNO. 1和/或沈QIDNO. 2,W及沈QIDNO. 3和/或沈QIDNO. 4的基础上经过一至十 个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
[000引基于相同的发明构思，本发明还提供了用于检测鸟胞内分枝杆菌复合群的化qman探针，包括具有序列表中SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6的两个化qman探针；两个所述探针 的5'端标记有报告巧光基团，3'端标记有泽灭巧光基团。
[0009] 较佳的，所述具有序列表中SEQIDNO. 5的探针的5'端标记J0E，3'端标记B册； 所述具有序列表中SEQIDNO. 6的探针的5'端标记FAM，3'端标记B册。
[0010] 由上述化qman探针序列的衍生序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是 在SEQIDNO. 5和/或SEQIDNO. 6的基础上，在序列的5'端和/或3'端添加一个或多 个碱基得到的序列。
[0011] 基于相同的发明构思，本发明还提供了鸟胞内分枝杆菌复合群检测试剂盒，包括 用于检测鸟胞内分枝杆菌复合群的引物和化qman探针。
[0012] 基于相同的发明构思，本发明还提供了一种检测鸟胞内分枝杆菌复合群的方法， 采用上述用于检测鸟胞内分枝杆菌复合群的引物和上述用于检测鸟胞内分枝杆菌复合群 的化qman探针，W待检测样本基因组DNA为模板，进行巧光定量PCR，其步骤如下：
[001引 1)提取待检测样本基因组DNA;
[0014]。配置巧光定量PCR反应体系：模板5y1，10Xhq酶buffer5y1，2.SmMdNTP4y1，用于检测鸟分枝杆菌的上游引物和下游引物各2y1，其浓度均为10iiM，用于检测胞 内分枝杆菌的上游引物和下游引物各2yl，浓度为IOiiM,序列表中SEQIDNO. 5和SEQID NO. 6的两个I'aqman探针各1y1，浓度均为10yM，Taq酶2. 5U，UNG酶0.Oly1，(1地2〇补至 SOiil；
[001 引 3)进行PCR反应：反应条件为：50°C2min;94°CSmin;94°C30s，60°C40s，共 40 个 循环；在巧光定量PCR仪上进行扩增，收集信号。
[0016] 从上面所述可W看出，本发明提供的鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探针、 W及其检测方法。利用鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌与其他分枝杆菌之间的基因组差异，设 计2对引物和2条探针，根据扩增的祀片段分别设计化qman探针，并对两条探针进行不同 的巧光标记，实现了在同一反应管中同时检测鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌，并通过不同的 巧光通道加W鉴别，扩增的同时可W直接在软件上判读结果，而不用跑电泳，避免了气溶胶 污染。具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特 点。与传统的鉴别方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
【附图说明】
[0017]图1为本发明的实施例中使用鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探针，W鸟分 枝杆菌基因组DNA为模板，进行巧光定量PCR扩增曲线图；
[001引图2为本发明实施例中使用鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探针，W胞内分 枝杆菌基因组DNA为模板，进行巧光定量PCR扩增曲线图；
[0019] 图3为本发明实施例中使用鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探针，W鸟分枝 杆菌和胞内分枝杆菌基因组DNA为模板，进行巧光定量PCR扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0020] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，W下结合具体实施例，并参照 附图，对本发明进一步详细说明。
[0021] 实施例1 :鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探针的设计与合成
[002引根据Pub-Med中基因库中所提供的各种分枝杆菌基因组序列进行比对，发现各种 分枝杆菌在在16SrRNA序列上有差异，分枝杆菌在16SrRNA的不保守区域，根据运些差别 来进行设计引物和探针，从而将鸟胞内分支杆菌复合群从中区分出来，具体序列如下： [0023] 针对鸟分枝杆菌的引物、探针为：
[0024]上游引物AF:5' -GGAAAGGCCTCTTCGGAGGT-3'（序列表中沈QIDNO.I);
[00巧]下游引物AR:5' -CGCAAAAGCTTTCCACCAGA-3'（序列表中沈QIDNO. 2)，
[0026] 探针AP序列为：5' -CGGATAGGACCTCAAGACGCATGTC-3'（序列表中沈QIDNO. 5)。
[0027] 针对胞内分枝杆菌的引物、探针为：
[0028] 上游引物JF:5' -CCCCTTCGGGGGTACTCG-3'（序列表中沈QIDNO. 3)，
[0029] 下游引物IR:5' -CCGCAAAAGCTTTCCACCTAA-3'（序列表中沈QIDNO. 4)，
[0030]探针IP序列为：5' -ACCGGATAGGACCTTTAGGCGCATG-3'（序列表中沈QIDNO. 6)。
[0031] 其中，两条化qman探针分别针对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌，鸟分枝杆菌的探针 AP的5'端标记J0E，3'端标记B册，胞内分枝杆菌的探针IP的5'端标记FAM，3'端标记 B册。当待测样品中只存在胞内分枝杆菌DNA时，反应体系中的胞内分枝杆菌体系会进行扩 增，在FAM通道有巧光信号出现，并有实时扩增曲线；当样品中只存在鸟分枝杆菌DNA时，反 应体系中鸟分枝杆菌体系会进行扩增，在JOE通道有巧光信号出现，并有实时扩增曲线；当 同时存在两种菌的DNA时，两个体系会同时工作（注：浓度比在1:103?内），在两个通道都 会出现实时扩增曲线，从而实现对两者的鉴别。通过在不同通道的巧光信号观察到的巧光 曲线来判断模板中是鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌。
[0032] 所有引物和探针的合成和标记都由上海生工来完成。
[0033] 实施例2 :应用本发明提供的引物和探针对鸟胞内分枝杆菌复合群检测
[0034] 1.提取待检测样本基因组DNA:
[0035] 1)取临床疲样本进行筛选并编号记录涂片结果；
[0036]2)配制8%化OH溶液；
[0037] 3)在生物安全柜内向疲液中加入等体积上述氨氧化钢溶液；
[0038] 4)剧烈震荡混匀后37°C液化1小时；
[003引 W取Iml液化后的样本至1. 5ml无菌离屯、管内；
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