一种定量检测ercc1-202的试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤基因检测技术领域，具体包括邸CC1-202亚型mRNA进行快速检测 的PCR引物、探针及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是人类的头号杀手，为攻克肿瘤人类付出了不懈的努力，也发明了大量 的抗肿瘤药物。然而，肿瘤耐药性的出现使抗肿瘤药物的疗效大打折扣。所W，目前的困境 是面对一种恶性肿瘤，我们不知道该选择哪一种抗肿瘤药物，也不知道某一个病人究竟对 哪些药物敏感，对哪些药物耐药。
[0003] 分子生物学的发展给运个难题提供了可能的解决方案。研究发现某些基因与抗 肿瘤药物的疗效有关，其中最重要的是肿瘤耐药基因。研究发现切除修复交叉互补基因 巧RCCl)表达的高低与销类耐药性成正相关，因此ERCCl基因可W指导临床用药。最新的研 究显示ERCCl拥有4个亚型：201-204,而只有其中的202亚型与销类耐药有关。所W检测 ERCC1-202可W更精确的反应药物的耐药性，然而运四种亚型高度同源，目前尚无合适的抗 体可W将202亚型从其他=个亚型中区分开来，在mRNA水平上，202亚型与其他=种亚型区 别也很小，至今尚无有效的可W单独检测202亚型的方法。
【发明内容】
[0004] 解决的技术问题：本发明提供一种定量检测ERCC1-202的试剂盒及应用，通过延 长扩增片段并针对ERCC1-202保守序列设计化qMan探针，结合0 -Actin基因作为参照，从 而实现了对新鲜肿瘤组织ERCC1-202的相对定量检测，可为肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌等 肿瘤病人使用销类化疗药物提供依据。
[000引技术方案：一种定量检测邸CC1-202的试剂盒，包括：
[0006] ￡贿(：1-202上游引物5'-66〔44441〇：44〔46〔41'〔41'-3'；
[0007]ERCC1-202 下游引物 5' -GCTCGTGCAGGACATCAAACA-3'；
[0008] 0-Actin内参的上游引物 5' -ATCCTCACCCTGAAGTACCC-3'；
[0009] 0-Actin内参的下游引物 5' -ACGCAGCTCATTGTAGAAGG-3'；
[0010]ERCC1-202 探针 5' -F-CAAATGTGGTCAGGAGGGTCT-Q-3'；
[0011] 0-Actin探针 5' -F-CAGATTTTCTCCATGTCGTCCCA-Q-3'；
[0012] 其中F为报告巧光基团，Q为泽灭巧光基团。
[001引所述报告巧光基团为FAM、TAMRA、JOE、肥X或TET;所述泽灭巧光基团为B册或MGB。
[0014] 所述定量检测ERCC1-202的试剂盒的应用，利用引物和探针分别对标准品及待 检检测样品进行巧光定量PCR扩增，扩增过程中收集巧光信号，PCR扩增体系包括Taq酶、Buffer、dNTP、ERCCl-202 上下游引物、ERCC1-202 探针、0-Actin上下游引物、0-Actin探 针、cDNA模版W及双蒸水；PCR扩增程序是95°C2min;95°C30sec，56°C50sec，循环40次。
[001引 PCR检测的标准品包括含有ERCCl-202质粒标准品和含有e-Actin基因的质粒标 准品；待检检测样品为从肿瘤组织中抽提的总RNA经反转录获得的cDNA。
[0016] 待检检测样品来源包括新鲜手术病理切片、肺部穿刺活检标本、内镜活检标本、胸 水脱落细胞、腹水脱落细胞或体外培养细胞。
[0017] 本发明原理：根据ERCClmRNA的四种亚型mRNA序列的差异，设计并筛选出能够用 于巧光定量PCR检测ERCC1-202的扩增引物和化qMan探针，设计并构建ERCC1-202标准 质粒及P-Actin内参的标准质粒，分别建立ERCC1-202标准曲线和P-Actin标准曲线， 不断优化PCR的反应体系，使WERCC1-202标准质粒为模版的PCR扩增效率与W0 -Actin 标准质粒为模版的PCR扩增效率一致，进而使用双标准曲线法分别计算出ERCC1-202及 P-Actin的拷贝数。本法具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点，弥补了现有技术在检 ERCCl基因202亚型方面的空白，具有较高的实用价值。
[0018] 试验方法及具体过程如下：
[0019] 首先获取新鲜组织样本0. 2g左右，放入SampleProtector化rRNA/DNA保存液 中4°C保存。在病理科医师确诊为恶性肿瘤后，使用Trizol法提取样品的总RNA。通过核 酸蛋白测定仪测定260nm和280nm光密度值计算RNA的纯度和浓度。反转录成cDNA，然后 配制PCR反应液进行巧光定量PCR。
[0020] PCR扩增程序是：95°C2min，95°C30s，56°C50sec，循环 40 次。
[0021] 反应结束后从巧光定量PCR仪中读取Ct值，根据ERCCl-202和e-Actin标准曲线 分别计算出ERCC1-202 及P-Actin含量，并计算出ERCCl-202/e-Actin，即为ERCC1-202 的相对含量。
[002引有益效果：
[0023] (1)本方法通过与内参基因表达对比实现相对定量，因而可用于比较不同病例之 间的ERCC1-202表达的高低，为肿瘤病人用药提供参考依据。
[0024] 似本方法可W特异性检测邸CCl基因的202亚型mRNA的表达量，不受其他亚型 干扰。
[0025] (3)本方法特异性强、敏感性高、结果稳定等优点，具有广泛的临床应用前景和巨 大的商业价值。
【附图说明】
[0026] 图1为实施例1中分别W含有邸CCl基因四种亚型的质粒为模版进行PCR后的扩 增图，只有ERCC1-202可W扩增，其它S种亚型均在一条直线上。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不限制本发明的保护范围和应用范 围。W下实施例中用到实验试剂如无特殊说明，均可通过商业手段获得。实施例中用到的 相关实验材料、试剂、仪器如下：
[002引 （1)实验材料
[0029]含有ERCCl基因四种亚型的祀GFP-Cl重组质粒、含有P-Actin基因的P細重组质 粒均由上海捷瑞生物工程有限公司构建，保存于东南大学附属中大医院检验科实验室。人 非小细胞肺癌细胞株A549细胞及耐药的A549细胞购自上海拜力生物科技有限公司，细胞 来源为美国ATCC细胞库。
[0030] 似试剂与仪器
[0031]hkaRahq?试剂盒及SampleProtectorforRNA/DNA保存液购自宝生物（大 连）工程有限公司。CFX96型实时PCR仪为BioRad公司产品。
[0032] 实施例1 :验证本方法对ERCC1-202的特异性
[003引 1.设计引物和探针
[0034] 针对ERCC1-202基因W及P-Actin基因，设计了用于多重巧光定量PCR检测的扩 增引物和化qMan探针，分别使用FAM、肥X、TET等基团作为探针的发光基团F，WMGB等基 团作为探针的泽灭基团Q，W对应于巧光定量PCR仪的不同波长同时检测。引物和探针序列 如表1所示。引物及修饰基团由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[003引表1检测ERCC1-202巧光定量PCR的引物和探针序列
[0037] 2.构建质粒标准品
[003引查询邸CCl基因四种亚型201、202、203、204核酸序列并合成该序列，经酶切连 接到质粒祀GFP-Cl中，并转化到化IO-GOLD感受态细胞中，涂布于LB/Kan+平板上，37 °C 培养，24小时后挑选单菌落扩增培养，并应用15%甘油保存菌种。分别取上述四种菌种各 5 y L，分别加入含有卡那霉素的5mL LB液态培养基中，37°C过夜培养，用质粒抽提试剂盒 提取质粒，经紫外分光光度计测定质粒的光吸收值（0D260)，计算出摩尔浓度。根据公式换 算成拷贝数：每y L样品中检测基因的拷贝数=浓度（ng/y UX阿佛加德罗常数X 107 化60X重组质粒碱基数）。将上述质粒于-20°C保存，使用前稀释。
[0039] 3.优化巧光定量PCR的反应体系
[0040] 通过反复试验，优化巧光定量PCR的反应体系，确定采用的PCR反应体系为总体积 25iiL质粒标准品5iiL用双蒸水补至25iiL。W双蒸水作10倍系列稀释成5个梯度，使 其浓度依次为1〇6拷贝/yL、10 5拷贝/yL、10 4拷贝/yL、10 3拷贝/yL、10 2拷贝/yL阴 性对照内加入灭菌双蒸水。经过反复试验得到最佳反应条件，如表2所示。最佳反应程序 为：95°C2min;95°C30sec，56°C50sec，40 个循环