一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及制作一种用于根据CagA和VacA双重毒力基因来对幽门螺杆菌同时进行分型和含量检测的方法，通过MGB探针双重荧光定量PCR技术检测不同浓度梯度的标准品中特异性基因CagA和VacA的拷贝数，来绘制基因拷贝数与Ct值关系的标准曲线，并利用此标准曲线来对患者胃粘膜上皮中幽门螺杆菌进行分型和含量测定。
【背景技术】
[0002]幽门螺杆菌jOj1ri, H.jOj1ri)是危害人类健康的重要病原体之一，它是感染胃部的最常见的病原性细菌。全世界的感染率为50%-80%，高发地区集中在东亚，包括中国、日本和韩国。/Z Arhri持续性感染可诱发慢性胃炎和萎缩性胃炎，进而引起胃粘膜细胞DNA损伤，H.pylori參与了从正常胃粘膜到“慢性胃炎一胃黏膜萎缩一肠化生一异型增生一胃癌”这一演变模式中的整个过程。我国是胃癌发病率和病死率较高的地区，每年全球新发100余万胃癌患者中，我国占42%，约80万死亡胃癌患者中，我国占35%，发病率和病死率均超过世界平均水平两倍多，而胃癌是H.jDj1ri长期感染与其他因素共同作用的结果。因此，快速、准确检测沒/yhri的含量，对沒/yhri感染的早期诊断、流行病学调查和公共卫生方面都具有重要意义。
[0003]TaqMan-MGB探针技术，是一种特异敏感的实时荧光定量PCR方法。与普通的Taqman探针比较，MGB探针具有两大特点:一是探针3’端标记了自身不发光的淬灭分子，使荧光本底降低，荧光光谱分辨率大大改善。二是探针3’端增加了一个MGB，可以稳定探针与模板的杂交，提高探针的退火温度。一方面缩短了探针长度，使荧光基团与淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好。另一方面，也提高了探针的特异性，是结果更准确，分辨率更高。因此，用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR技术，对汉进行定量分析，并将此技术应用于临床标本检测具有$父尚的公共卫生意义。
[0004]CagA是汉表达的主要毒力蛋白之一，为H.与宿主相互作用的重要效应蛋白，VacA基因几乎存在所有的H.菌株中，编码表达VacA蛋白，VacA蛋白为空泡毒素，能够引起靶细胞空泡样变。目前根据有无CagA蛋白将/Z /yhri分为两型，I型菌:有CaM基因，表达CagA蛋白，具有VacA毒素活性，主要分布在东亚地区，如中、日、韩等国，有90%~95%的H.PyI ori% CagA阳性；11型菌:无CagA基因，不表达CagA蛋白，无VacA毒素活性，主要分布在西方国家，如欧洲、美国、澳大利亚，/Z /3J1ri大约40%为CagA阴性。因此，通过H.国际标准株26695的两个特异性毒力基因CagA和VacA的体外重组技术获得重组质粒，并将此高浓度重组质粒作为标准品，利用MGB探针二重荧光定量PCR技术形成标准曲线，再通过MGB探针二重荧光定量PCR技术同时检测患者胃粘膜上皮中CagA和VacA基因的表达情况，从而推测患者H./yhri含量和类型，具有良好的临床样本检测的应用价值。
[0005]本发明中根据CagA和VacA基因序列设计的双重荧光定量PCR的引物和探针建立的标准曲线，具有良好的扩增效率，将此标准曲线用于临床样本的检测亦表现出了较高的特异性、灵敏性和稳定性，这不仅对沒/yhri临床样本检测提供和科学的理论依据和技术支持，而且对沒/yhri流行病调查和防控具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种用于针对幽门螺杆菌的检测方法，可同时进行分型和定量。通过MGB探针双重荧光定量PCR技术制作幽门螺杆菌特异性毒力基因CagA和VacA拷贝数与循环数的标准曲线，并利用此标准曲线来对临床胃炎患者胃粘膜上皮中的幽门螺杆菌进行同时分型和定量，来达简化检测步骤的目的。具体方法如下:
1、构建CagA和VacA重组质粒标准品
用菌环刮取含有CagA和VacA双毒力基因的标准菌株悬于盛有I ml PBS的离心管，涡旋震荡混匀，充分洗涤菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)说明书提取汉pylori基因组DNA。通过PCR技术，使用基因特异性引物Pl(5，-AAGCCACAACGCTCACCAA-3’ )和 P2 (5，- AATGGGCTCTTCAGGGCTA-3’ ) ψ 增 H.pyloriCagA 片段，使用基因特异性引物 P3 (5’ -ATGGAAATACAACAAACACAC-3’ )和 P4 (5’ -GCTAAGAAGCCCTGAGACC-3’ )扩增VacA片段。反应条件为:首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共进行30个循环，最后72°C延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与PMD18-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒。用适当量程的移液器准确量取2 μ I DNA母液，加入适量的缓冲液和指示剂，于0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，判断其降解及污染情况。并结合核算标准分子量的亮度和质量，粗略确定提取DNA的浓度。
[0007]根据估测的浓度，取一定量DNA母液，稀释至100 μ 1，利用紫外可见分光光度计检测0D260和0D280，计算两者的比值，若比值在1.6-1.8之间，则DNA纯度符合要求。根据公式计算=DNA浓度(ng.μ1 ')= 0D260X50X样品稀释倍数。将CagA和VacA质粒DNA的浓度换算为拷贝数分别为:3.64Χ 101°拷贝/μ?和4.28X10 10拷贝/μ?。用EasyDilut1n将上述质粒依次稀释成1.0X 18拷贝/μ1-1.0Χ10°拷贝/μ?，共9个浓度梯度，备用。
[0008]绘制CagA和VacA的MGB探针双重荧光定量PCR标准曲线
根据CagA和VacA的基因序列各合成一段MGB探针TcagA: FAM-CCCATTTATGCTAAAGTT-MGBNFQ 和 TvacA: VIC-ACC GTG ATC ATT CCA G-MGBNFQo 以 CagA 和 VacA 质粒系列浓度梯度为模板(1.0 X 18拷贝/μ1-1.0Χ10°拷贝/μ? )，按照如下反应体系进行双重荧光定量 PCR 反应:引物 Ρ1、Ρ2、Ρ3、Ρ4 各 0.2μ1，探针 TcagA 和 TvacA 各 0.4μ1，Mix 为 10μ1，H2O为6.4μ1，模板2μ1，总体积至20μ1。反应条件为:首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性5秒，60°C退火20秒，共进行40个循环。以CagA和VacA质粒浓度梯度值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制CagA和VacA的MGB探针双重荧光定量PCR标准曲线。
[0009]探针双重荧光定量PCR技术检测临床样本幽门螺杆菌的分型和含量
秤取适量胃粘膜组织，加生理盐水在研钵中研磨成匀浆状，倒入离心弃上清，用PBS洗涤，离心沉淀，加裂解液，100°C静置lOmin，离心后得到的上清即为待测样品DNA模板。
[0010]按照上述MGB探针双重荧光定量PCR检测方法检测临床样本幽门螺杆菌的拷贝数，计算得到细菌含量，若样品中幽门螺杆菌含有两种毒力基因，得到两个循环数，对照标准曲线得到两个基因的拷贝数，取平均值。若其中一种基因的循环数显示为N/A，则表示样本中的幽门螺杆菌不含有此基因，为该基因阴性菌。
【附图说明】
[0011]图1:基因拷贝数Ig值与Ct值关系的标准曲线。
【具体实施方式】
[0012]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人