员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0013]实施例1
制备CagA和VacA重组质粒
幽门螺杆菌国际标准株26695基因组DNA的提取:用菌环刮取适量菌落悬于盛有I ml PBS的离心管中涡旋震荡混匀，充分洗涤菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)说明书提取幽门螺杆菌基因组DNA。通过PCR技术，使用基因特异性引物Pl(5’ -AAGCCACAACGCTCACCAA-3’)和 P2(5’ - AATGGGCTCTTCAGGGCTA-3’)扩增 CagA 片段，使用基因特异性引物P3(5’-ATGGAAATACAACAAACACAC-3’)和P4(5’_ GCTAAGAAGCCCTGAGACC-3’ )扩增VacA片段。
[0014]PCR反应条件为:首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共进行30个循环，最后72°C延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与PMD18-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒。用适当量程的移液器准确量取2 μ I DNA母液，加入适量的缓冲液和指示剂，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，判断其降解及污染情况。并结合核算标准分子量的亮度和质量，粗略确定提取DNA的浓度。根据估测的浓度，取一定量DNA母液，稀释至100 μ 1，利用紫外可见分光光度计检测0D260、0D280，计算两者的比值。根据DNA的计算公式:DNA浓度(ng.μ? ') = 0D260X50X样品稀释倍数。根据计算得到两种重组质粒的分子量，将CagA和VacA质粒DNA的浓度换算为拷贝数分别为:3.64X 101°拷贝/μ?和4.28X10 10拷贝/μ?。用EasyDilut1n将上述质粒依次稀释成1.0X 18拷贝/μΙ-LOXlO。拷贝/μ?，共9个浓度梯度，备用。
[0015]绘制CagA和VacA的MGB探针双重荧光定量PCR标准曲线
首先，根据CagA和VacA的基因序列各合成一段MGB探针TcagA:FAM-CCCATTTATGCTAAAGTT-MGBNFQ 和 TvacA: VIC-ACC GTG ATC ATT CCA G-MGBNFQo 以 CagA 和 VacA 质粒系列浓度梯度为模板(1.0 X 18拷贝/μΙ-LOXlO。拷贝/μ?)，
按照如下反应体系进行双重荧光定量PCR反应:
引物 Ρ1、Ρ2、Ρ3、Ρ4 各 0.2μ1，
探针 TcagA 和 TvacA 各 0.4μ1，
Mix 为 10μ1，
H2O 为 6.4μ1，
模板2μ1，
总体积至20μ1 ；
反应条件为:首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环: 94°C变性5秒，60°C退火20秒，共进行40个循环；
以CagA和VacA质粒浓度的Ig值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制CagA和VacA的MGB探针双重焚光定量PCR标准曲线。得到图1标准曲线。
[0016]探针双重荧光定量PCR技术检测临床样本幽门螺杆菌含量
患者样品编号I作为待测品，秤取20mg胃粘膜组织，加2ml生理盐水在研钵中研磨成勾楽状，倒入1.5ml离心管中，13000rpm离心5min,弃上清，用PBS洗涤三次后13000rpm离心沉淀，加入50 μ L裂解液，100C静置lOmin，13000rpm离心，上清即为待测样品DNA模板。
[0017]按照上述MGB探针双重荧光定量PCR检测方法检测临床样本幽门螺杆菌的拷贝数为20，对照步骤2中得到的标准曲线CagA和VacA两种基因的拷贝数分别为1.6X 16拷贝/μ?和IX 17拷贝/μ?，取平均值为5.8Χ 10 6拷贝/μ?，由此可得知细菌含量。
[0018]实施例2
本实施例与实施例1的不同点是:
在步骤3中，以患者样品编号2作为待测品，按照实施案例I中的方法处理后，使用MGB探针双重荧光定量PCR检测方法检测临床样本幽门螺杆菌的循环数为25，其中VacA的循环数显示为Ν/Α，表明样品中幽门螺杆菌只含有CagA —种毒力基因，呈VacA阴性幽门螺杆菌。对照标准曲线得到拷贝数约为I X 15拷贝/μ?，由此可得知细菌含量。
【主权项】
1.一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于该方法包括如下步骤: A用试剂盒提取幽门螺杆菌的国际标准株基因组DNA，合成目的基因的特异性引物，制备分别含有CagA和VacA的重组质粒； B将重组质粒测浓度后梯度稀释，根据CagA和VacA的基因序列各合成一段MGB探针，进行双重荧光定量PCR反应，绘制基因循环数和拷贝数的关系，获得标准曲线； C取患者胃粘膜上皮，经适当处理后提取DNA，按照上述MGB探针双重荧光定量PCR检测方法检测临床样本幽门螺杆菌，根据Ct值可进行细菌分型，拷贝数可反映细菌含量。2.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于:幽门螺杆菌的国际标准菌株编号为26695，含有CagA和VacA双重毒力基因。3.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于:由MGB探针双重荧光定量PCR得到的标准曲线为CagA和VacA双基因的标准曲线。4.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于:所述重组质粒所使用的载体是PMD18-T载体。5.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于:CagA的特异性引物为:(5’ -AAGCCACAACGCTCACCAA-3’ )和P2 (5’ -AATGGGCTCTTCAGGGCTA-3’ )；VacA 的特异性引物为:P3 (5，-ATGGAAATACAACAAACACAC-3’)和P4 (5，- GCTAAGAAGCCCTGAGACC-3， )06.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于:特异性 MGB 探针为 TcagA:FAM-CCCATTTATGCT AAAGTT-MGBNFQ 和 TvacA: VIC-ACC GTGATC ATT CCA G-MGBNFQo7.根据权利要求6所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于:FAM，VIC为荧光基团，MGBNFQ为非荧光淬灭基团。8.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于:PCR反应条件为:首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性5秒，60°C退火20秒，共进行40个循环。
【专利摘要】本发明公开了一种制作可用于检测患者胃粘膜上皮中幽门螺杆菌方法，可以同时进行分型和定量，属于生物学检测的领域。涉及到利用MGB探针双重荧光定量PCR技术测定患者胃粘膜上皮中幽门螺杆菌含量的方法。还涉及到利用MGB探针双重荧光定量PCR技术制作幽门螺杆菌特异性毒力基因CagA和VacA双基因的标准曲线。本发明能大幅提高检测患者胃粘膜中幽门螺杆菌的效率，简化检测程序。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04, C12R1/01
【公开号】CN105219883
【申请号】CN201510805753
【发明人】张莹, 李波清, 陈醒醒, 孙辉, 徐宁
【申请人】滨州医学院
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月20日