一种茯苓多糖、其制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药学和免疫学领域，涉及一种茯苓多糖、其制备方法及用途。具体 地，本发明还涉及一种药物组合物以及所述茯苓多糖用于制备疫苗佐剂、疫苗组合物或抗 体的用途。
【背景技术】
[0002] 获考:（Poria)为非裙菌目（Aphyllophorales)、多孔菌科（Polyporaceae)、获茶属 (Poria)、真菌获茶（Poria cocos) (Schw. )Wolf.的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾、宁心之 功效（中国药典，2010版，p224)。近年来与本发明领域相关的研究和报道归纳如下：
[0003] 余建国等（余建国，等.中国兽医科技，2004,34(11) :70-74)给1日龄的雏鸡腹 腔注射马立克氏病病毒（MDV)强毒株（0.2mL/只），并从当日开始给试验组雏鸡以1、2和 3mg/只的剂量连续肌肉注射茯苓多糖1周。结果表明3个剂量茯苓多糖均可显著提高雏鸡 的淋巴细胞转化率、NK细胞活性及ΜΦ活性。
[0004] 张志军等（张志军，等.中国免疫学杂志，2013, 29:1213-1216)将含60%茯苓多 糖混合物（还含有三萜类化合物、乙酰茯苓酸、茯苓酸、胆碱，3β-羟基羊毛留三烯酸，葡萄 糖、腺嘌呤、组氨酸等，未提及制备方法）按〇. 4、0. 8和1. 6mg/鼠的剂量灌胃给予小鼠一 周。发现小鼠血清中IgA、IgG和IgM水平高于生理盐水对照组，且存在剂量-效应关系。
[0005] 谢国秀等（谢国秀，等.生命科学研究，2009, 13 (3) :246-248)将不同剂量 (200μg或1000μg)的茯苓多糖分别与低剂量（0. 015μg)或高剂量（1. 5μg)流感病毒 (A/PR/8)灭活疫苗共同免疫小鼠。一次免疫后3周收集血清，检测血清中IgG、IgGl和 IgG2a的抗体水平，并用致死量（40XLD50)流感病毒（A/PR/8)攻击小鼠。结果表明茯苓多 糖能增加血清抗体水平，提高小鼠抗致死量流感病毒攻击的能力，其免疫增强效果与氢氧 化铝相当。
[0006] 王青等（王青，等.中国实验方剂学杂志，2011，17(13) :127-130)观察茯苓多糖 对卵清白蛋白（0VA)诱导的小鼠肠道黏膜免疫应答的影响。茯苓多糖每天按200mg/kg剂 量灌胃给药小鼠，1周后1次性灌胃抗原〇VA5mg，对小鼠进行免疫，分别于免疫后1，2,3周， 收集小鼠粪便样本，ELISA检测小鼠粪便0VA特异性分泌型免疫球蛋白A (slgA)。结果表明 茯苓多糖对肠道slgA分泌具有促进作用，这与其活化淋巴结B淋巴细胞有关。
[0007]Lee等（Lee等.和汉医药学杂志，1999,16 (526) :175-182)在肺炎球菌gV型多糖 类蛋白质结合抗原接种小鼠前，预先注射当归多糖和茯苓多糖〇. 2-1.Omg。结果表明较未 用多糖组gvPSIgG与IgM生成明显增加。中药多糖组小鼠用有毒力的19F型肺炎球菌攻击 后，血中的细菌迅速清除。用gV型肺炎球菌多糖类蛋白质结合抗原免疫小鼠的脾细胞与中 药多糖共育后，TNF-a的生成较对照组高4. 0-5. 5倍，IL-2高15-39倍，IL-4高4. 6 - 64 倍。茯苓多糖还诱导IFN-γ生成增加。
[0008]Lee等（Lee,etal.InternationalImmunopharmacology, 2004,4:1029-1038)米 用1%碳酸钠提取茯苓，获得水提物。水提物经过乙醇沉淀、DEAE-纤维素和S印hadexG-50 柱层析，获得一个分子量为8000Da的糖肽（PCSC)，PCSC中糖与肽的百分比为78 :22。糖部 分含有甘露糖（92% )、半乳糖为6. 2%，阿拉伯糖为1. 3%。肽部分主要含有天冬氨酸、丝 氨酸和缬氨酸。PCSC能显著活化RAW264. 7巨噬细胞，活化NF-κB/Rel和NO的分泌。
[0009]Chen等（Chen,etal.FoodandChemicalToxicology, 2004, 42:759-769)从获茶 中分离得到1个中性多糖组分（PC-PS)，分子量为160000Da。PC-PS能抑制人白血病U937 细胞和HL-60的增殖和分化，能提高TFN-α和IFN-γ的分泌。
[0010] 归纳以上研究结果，可以看出茯苓多糖能提高受药动物的体液免疫和细胞免疫能 力，但未明确阐明使用的茯苓多糖的具体制备方法和理化性质。
[0011] 不同的制备方法所获得的茯苓多糖具有本质差别，理化性质往往存在截然不同的 区别，生物学活性亦不相同。
[0012] 目前，尚需要制备新的茯苓多糖。
【发明内容】
[0013] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种茯苓多糖。本发明人惊奇 地发现，所述茯苓多糖具有良好的疫苗佐剂作用。由此提供了下述发明：
[0014] 本发明的一个方面涉及一种茯苓多糖，其中，组成该茯苓多糖的单糖包括岩藻糖、 甘露糖、葡萄糖和半乳糖。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，组成该茯苓多糖的单糖为岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和 半乳糖。
[0016] 根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其中，岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之间 的摩尔比依次为 1 : (1 - 2) : (0· 3 - 4) : (2 - 3. 5);具体地，为 1 : (1 -L5) : (0· 5 - 3. 5): (2 - 3. 5);更具体地，为 1 : (1. 3 - 1. 5) : (0· 5 - 1. 8) : (2. 6 - 3)。
[0017] 在本发明的具体的实施方式中，藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之间的摩尔比依次 分别如表2中的摩尔比所示。
[0018] 根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其中，按照葡萄糖计算，其含糖量为20% - 80%、20% - 60%、20% - 40%、40% - 80%、40% - 60%、20%、40%、60% 或 80%。
[0019] 在本发明的具体的实施方式中，按照葡萄糖计算，茯苓多糖的含糖量分别如表1 所示。
[0020] 根据本发明任一项所述的获茶多糖，其分子量在IXl〇4Da- 8X105Da之间。具体 地，该分子量范围是不连续的。
[0021] 根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其包含如下两个多糖组分：
[0022] 组分 1 (PCP-1):分子量范围为 1X104Da- 8X104Da;
[0023]组分 2 (PCP-2):分子量范围 2X105Da- 8X105Da;
[0024] 具体地，组分1的峰商分子量为2. 71X104Da;组分2的峰商分子量为 6. 47X105Da。具体数据见附图1和附图2。
[0025] 根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其大分子成分仅由组分1和组分2组成。具 体地，所述大分子成分为分子量3IXl〇4Da的成分。
[0026] 根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其仅由组分1和组分2组成。
[0027] 上述任一项所述的茯苓多糖，其亦可称为茯苓总多糖或者茯苓提取物；其可由下 面任一项所述的制备方法制得。
[0028] 本发明的另一方面涉及一种制备茯苓多糖的方法，包括下述步骤：
[0029] 1)将茯苓药材用水进行浸提，得到水提液；
[0030] 在本发明的一个实施方案中，提取温度为50 - 60°C，浸提时间为5小时，提取2 次。
[0031] 2)将步骤1)中得到的水提液在50°C-60°C下减压浓缩，浓缩液加入乙醇进行沉 淀，得到沉淀物；
[0032] 在本发明的一个实施方案中，茯苓水提浓缩液加入3倍体积的乙醇，醇沉时间为 72小时。
[0033] 3)将步骤2)中得到的沉淀物加水溶解，溶解液进行透析或超滤；
[0034] 4)将步骤3)中透析所得的袋内透析液或者超滤截留液在50°C- 60°C下减压浓 缩，得到浓缩液；
[0035] 5)将步骤4)中得到的浓缩液进行冷冻干燥或喷雾干燥，得到茯苓多糖。
[0036] 根据本发明任一项所述的制备方法，其特征在于如下的（1) 一（14)项中的任意一