一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制 多肽及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 血管紧张素转换酶（AngotensinConvertingEnzyme，ACE)是一种存在于不 同组织里的多功能胞外含锌二羧肽酶，能被氯离子激活并具有较宽的底物特异性。它 在肾素-血管紧张素系统（RenialAngiotensinSystem，RAS)和激肽酶-激肽系统 (Kallikrein-Kinin，KKS)具有重要和关键的生理功能。它的主要作用是把血管紧张素 I(AngiotensinIConvertingEnzyme)车专化成血管紧张素II(AngiotensinIIConverting Enzyme)，同时还会使血管舒缓激肽失活，最终导致人体血压升高。
[0003] 血管紧张素转换酶抑制多肽是由数个氨基酸组成具有生物活性的多肽，并且对 ACE活性区域具有较强亲和力的抑制剂，它们与ACE的亲和力比血管紧张素I或舒缓激肽更 强，而且也较不容易从ACE结合区释放，降低ACE活性或使其失去活性，从而阻碍ACE催化 血管紧张素I转化成血管紧张素II，以及阻碍ACE水解舒缓激肽成为失活片段，从而达到降 低血压的作用。
[0004] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽，其从蚕蛹蛋白 的水解产物中提取得到，其具有明显的ACE抑制活性，为制备降血压药物提供理论指导。
[0006] 本发明提供了一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示。
[0007] 本发明还提供了所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法，包括 如下步骤：
[0008] (1)将冷冻蚕蛹按照1:3的比例加入到蒸馏水中，匀浆搅拌lh后过滤，重复3次； 合并滤液，滤液在100°C水浴条件下加热30min至蛋白变性，再调节pH为3. 0使蛋白沉 降，蛋白溶液在4°C条件下静置12h，使蛋白充分沉淀与溶液分层，随后高速冷冻离心4°C、 8000r/min离心45min去除上清液，收集沉淀，干燥，即得到蚕蛹粗蛋白粉；
[0009] (2)将蚕蛹粗蛋白粉按照质量比1:50加入到蒸馏水中，完全溶解，然后加入1. 5% 的中性蛋白酶，在pH为7. 0,温度为50°C条件下进行酶解，酶解时间为3h;酶解完成后在 90°C水浴灭活10min，水解液离心后取上清液；用截留分子量为5KDa超滤膜过滤，将超滤透 过液冷冻干燥，得到冻干粉末；
[0010] (3)将步骤（2)中得到的冻干粉末溶解在浓度为0· 01m〇l/L，pH为8. 5的磷酸盐 缓冲液中；以1.OmL/min的速度上样于平衡好的阴离子交换树脂色谱柱，用磷酸盐缓冲液 洗柱至在220nm处吸收峰回到基线，洗脱流速为1.OmL/min;用NaCl溶液对样品进行梯度 洗脱，洗脱流速为1.OmL/min，洗脱梯度为0-1.Omg/mL;按照时间段收集各个组分进行冷冻 干燥并检测活性，在_20°C条件下保存；
[0011] (4)将步骤（3)中活性最好的冻干粉末上样于平衡好的S印hadexG-15凝胶色谱 柱，以水为流动相进行洗脱，洗脱流速为1.OmL/min;检测波长为280nm;按照时间段收集各 个组分进行冷冻干燥并检测活性，在_20°C条件下保存；
[0012] (5)将步骤（4)中活性最好的冻干粉末溶解在超纯水中，进行反相高效液相色谱 分离，流动相，A相：含0. 1%三氟乙酸的纯水；B相：乙腈；检测波长为220nm，分段收集各个 组分进行冷冻干燥并检测活性，在_20°C条件下保存；
[0013] (6)将步骤（5)得到的活性最好的冻干粉末再次经过反相高效液相色谱分离， 流动相，A相：含0. 1 %三氟乙酸的纯水；B相：乙腈；检测波长为220nm，收集保留时间为 17. 5-20min的组分进行冷冻干燥，即得血管紧张素转换酶抑制多肽。
[0014] 作为优选，步骤（5)中所述的乙腈进行梯度洗脱，其浓度在0-60min时间内从5% 上升为30%。
[0015] 作为优选，步骤（6)中所述的乙腈进行梯度洗脱，其浓度在0-30min时间内从7% 上升为9%。
[0016] 本发明还提供了所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在制备降血压药 物中的应用。
[0017] 本发明还提供了所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在制备食品中的 应用。
[0018] 本发明还提供了所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在制备保健品中 的应用。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0020] (1)本发明从蚕蛹蛋白的水解产物中分离得到了一种具有ACE抑制活性的血管紧 张素转换酶抑制多肽，为治疗高血压的食品、药物或保健品的开发利用提供了一种全新的 途径。
[0021] (2)本发明的原料来源于丝绸工业的副产物蚕蛹，其资源丰富、价格低廉，具有非 常广泛的应用前景。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法中的离子交换 色谱图及各组分抑制率图。
[0023] 图2为本发明蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法中的凝胶色谱 图及各组分抑制率图。
[0024] 图3为本发明蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法中的第一次反 相高效液相色谱图。
[0025] 图4为本发明蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法中的第二次反 相高效液相色谱图。
[0026]图5为本发明制备的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在不同的贮藏温度 下含量变化图。
[0027] 图6为本发明制备的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在不同的贮藏温度 下对ACE抑制率的变化图。
[0028]图7为本发明制备的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在人工模拟消化后 含量变化图。
[0029]图8为本发明制备的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在人工模拟消化后 对ACE抑制率的变化图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0031] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所以用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]实施例1:血管紧张素转换酶抑制多肽的制备
[0034] (1)将冷冻蚕蛹按照1:3的比例加入到蒸馏水中，匀浆搅拌lh后过滤，重复3次； 合并滤液，滤液在100°C水浴条件下加热30min至蛋白变性，再调节pH为3. 0使蛋白沉 降，蛋白溶液在4°C条件下静置12h，使蛋白充分沉淀与溶液分层，随后高速冷冻离心4°C、 8000r/min离心45min去除上清液，收集沉淀，干燥，即得到蚕蛹粗蛋白粉；
[0035] (2)将蚕蛹粗蛋白粉按照质量比1:50加入到蒸馏水中，然后往溶液中加入1. 5% 的中性蛋白酶，在pH为7. 0、温度为50°C条件下进行酶解，酶解时间为3h;酶解完成后在 90°C水浴灭活lOmin，水解液离心后取上清液；用截留分子量为5kDa超滤膜过滤，将超滤透 过液冷冻干燥，得到冻干粉末；
[0036] (3)将步骤⑵中得到的粉末溶解在浓度为0·Olmol/L、pH为8. 5的磷酸盐缓冲 液中；以1. 0mg/mL的速度上样于平衡好的的D201阴离子交换树脂色谱柱（10X300mm)，用 磷酸盐缓冲液洗柱至在220nm处吸收峰回到基线，洗脱流速为1.Omg/mL;用NaCl溶液对样 品进行梯度洗脱，洗脱流速为1.Omg/mL，洗脱梯度为0-1.Omg/mL;收集各个组分进行冷冻 干燥并检测活性（见图1)，在_20°C条件下保存；
[0037] (4)将步骤（3)得到的活性最好的冻干粉末（即组分IE1)上样于平衡好的 SephadexG-15凝胶色谱柱（20X500mm)，以水为流动相进行洗脱，洗脱流速为1.Omg/mL; 检测波长为280nm;收集各个组分进行冷冻干燥并检测活性（见图2)，在-20°C条件下保 存；
[0038] (5)将步骤（4)得到的活性最好的冻干粉末（即组分GF2)溶解在超纯水中，进 行反相高效液相色谱进行分离。流动相，A相：纯水（含0. 1 %三氟乙酸）；B相：乙腈，在 0-60min时间内进行梯度洗脱，乙腈浓度为5-30%;检测波长为220nm，收集各个组分（见 图3、表1)进行冷冻干燥并检测活性，在-20°C条件下保存。
[0039] 表1第一次高效反相液相色谱分离各组分抑制活性（样品浓度0· 006mg/mL)
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[0041] 表2第二次高效反相液相色谱分离各组分抑制活性（样品浓度0·004mg/mL)
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