0042]
[0043] (6)将步骤（5)得到的活性最好的冻干粉末（即组分HP6)再次经过反相高效色谱 进行分离。流动相，A相：含0. 1 %三氟乙酸的纯水；B相：乙腈，在0-30min时间内进行梯度 洗脱，乙腈浓度为7-9%，检测波长为220nm，收集各个组分（见图4、表2)进行冷冻干燥并 检测活性，在-20°C条件下保存。收集保留时间为17. 5-20min的组分（即HP64)，即可得到 血管紧张素转换酶抑制多肽。
[0044] 将上述制备得到的血管紧张素转换酶抑制多肽ACE抑制活性进行测定。
[0045]ACE抑制活性的测定原理为：多肽的ACE抑制活性测定采用体外模拟测定法，其原 理为：底物马尿酰组胺酰亮氨酸（HHL)在ACE的催化作用下，可以水解生成马尿酸（HA)与 一个组氨酸和亮氨酸结合的二肽，通过高效液相色谱法检测生成的马尿酸的含量，可以测 定ACE活性；而ACE抑制多肽的存在可以抑制ACE的活性，导致HA的生成量减少，可以间接 测定ACE抑制多肽的活性。
[0046] ACE抑制活性的测定的方法步骤如下：选取eppendof(EP)管作为反应器，编号A、 B、C，按表3的反应体系进行试验，测定ACE抑制多肽对ACE的抑制活性。
[0047] 表3ACE抑制多肽体外活性检测反应体系
[0048]
[0049] 反应终止之后过0.45μm的滤膜，然后利用高效液相色谱法（HPLC)测定HA的含 量。
[0050] 液相条件为：15%甲醇：85%超纯水（含0·1%TFA)，检测波长228nm，柱温25°C， 上样量20μL。
[0051] ACE抑制率（ΙΑ)按照下式计算：
[0052]
[0053] 上式中：ΙΑ表示ACE抑制率（％ ) 43表示由于底物自身水解所生成的马尿酸的色 谱峰面积（空白）；Ab表示反应体系中不存在ACE抑制剂的条件下的马尿酸按色谱峰面积 (对照）；A。表示ACE及ACE抑制剂均存在的条件下的马尿酸色谱峰面积（样品）。
[0054] 经测定，本发明制备的血管紧张素转换酶抑制多肽的体外ACE抑制IC50为 12.61μg/mL〇
[0055] 实施例2:血管紧张素转换酶抑制多肽的序列分析
[0056] 取实施例1中所制备得到的血管紧张素转换酶抑制多肽，经基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱（MALDI-T0F/T0F-MS)测定，其分子量为603. 7Da，其氨基酸序列为： Gly-Asn-Pro-Trp-Met(如SEQIDNO: 1 所不）〇
[0057] 实施例3:贮藏温度对血管紧张素转换酶抑制多肽的含量及抑制率影响
[0058] 将实施例1中所制备得到的血管紧张素转换酶抑制多肽溶解在0.lmol/L硼酸缓 冲液（含似(：10.3111〇1/1、？!18.3)中。将多肽溶液在40°(：、60°(：、80°(：条件下贮藏611。结 束之后，测定溶液中多肽的含量（见图5)及其对ACE的抑制率（见图6)。按照下式计算多 肽含量保存率：
[0059]
[0060] 结果表明：在不同的贮藏温度下保存6h后，血管紧张素转换酶抑制多肽的含量略 微下降（图5)，但仍保留有较高的ACE抑制率（图6)，这说明该血管紧张素转换酶抑制剂 具有较好的热稳定性。
[0061] 实施例4:人工模拟消化对血管紧张素转换酶抑制多肽的活性影响
[0062] 按照《中国药典2010版》提供的方法配置人工胃液和人工肠液，将实施例1制备 的血管紧张素转换酶抑制多肽与人工胃液按照1:1混合，消化处理2h后调节pH值为7. 0， 与人工肠液1:1混合，消化处理4h。在0、2 (取样40μL)和6h(取样80μL)分别取样测定 溶液中多肽的含量（见图7)及其对ACE的抑制率（见图8)。
[0063] 结果表明：在经过人工胃液处理之后，血管紧张素转换酶抑制多肽的含量略微下 降（图7)，但ACE抑制率变化不大（图8);随后再经过人工肠液的处理，血管紧张素转换酶 抑制多肽的含量剧烈下降（图7)，同时，ACE抑制率升高（图8)，这说明经过人工肠液处理 之后具有更好的ACE抑制率，能为降血压药物的研究提供理论指导。
[0064] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变 和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及 各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
[0065] SEQUENCE LISTING <、110>广西大学 <120> -种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽及其制备方法和应 用 <13〇> 2Θ15<100'· 4 <1.7.0〉. Patentin version 3.3 <210 1 <21.1>S 〇]2> PRT <213> Bombyx mori L. <400> 1 Gly Asn Pro Trp Met1 5
【主权项】
1. 一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。2. 根据权利要求1所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法，其特征 在于，包括如下步骤： (1) 将冷冻蚕蛹按照1:3的比例加入到蒸馏水中，匀浆搅拌Ih后过滤，重复3次；合 并滤液，滤液在l〇〇°C水浴条件下加热30min至蛋白变性，再调节pH为3. 0使蛋白沉降，蛋 白溶液在4°C条件下静置12h，使蛋白充分沉淀与溶液分层，随后高速冷冻离心4°C、8000r/ min离心45min去除上清液，收集沉淀，干燥，即得到蚕蛹粗蛋白粉； (2) 将蚕蛹粗蛋白粉按照质量比1:50加入到蒸馏水中，完全溶解，然后加入1. 5%的中 性蛋白酶，在PH为7. 0,温度为50°C条件下进行酶解，酶解时间为3h ;酶解完成后在90°C水 浴灭活lOmin，水解液离心后取上清液；用截留分子量为5KDa超滤膜过滤，将超滤透过液冷 冻干燥，得到冻干粉末； (3) 将步骤（2)中得到的冻干粉末溶解在浓度为0.0 lmol/L，pH为8. 5的磷酸盐缓冲 液中；以1.0 mL/min的速度上样于平衡好的阴离子交换树脂色谱柱，用磷酸盐缓冲液洗柱 至在220nm处吸收峰回到基线，洗脱流速为1.0 mL/min ;用NaCl溶液对样品进行梯度洗脱， 洗脱流速为1.0 mL/min，洗脱梯度为0-1. Omg/mL ;按照时间段收集各个组分进行冷冻干燥 并检测活性，在_20°C条件下保存； ⑷将步骤⑶中活性最好的冻干粉末上样于平衡好的Sephadex G-15凝胶色谱柱，以 水为流动相进行洗脱，洗脱流速为1.0 mL/min ;检测波长为280nm ;按照时间段收集各个组 分进行冷冻干燥并检测活性，在_20°C条件下保存； (5) 将步骤⑷中活性最好的冻干粉末溶解在超纯水中，进行反相高效液相色谱分离， 流动相，A相：含0. 1 %三氟乙酸的纯水；B相：乙腈；检测波长为220nm，分段收集各个组分 进行冷冻干燥并检测活性，在_20°C条件下保存； (6) 将步骤（5)得到的活性最好的冻干粉末再次经过反相高效液相色谱分离，流动相， A相：含0. 1%三氟乙酸的纯水；B相：乙腈；检测波长为220nm，收集保留时间为17. 5-20min 的组分进行冷冻干燥，即得血管紧张素转换酶抑制多肽。3. 根据要求2所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法，其特征在 于：步骤（5)中所述的乙腈进行梯度洗脱，其浓度在0-60min时间内从5%上升为30%。4. 根据要求2所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法，其特征在 于：步骤(6)中所述的乙腈进行梯度洗脱，其浓度在0_30min时间内从7%上升为9%。5. 根据权利要求1所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在制备降血压药物 中的应用。6. 根据权利要求1所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在制备食品中的应 用。7. 根据权利要求1所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在制备保健品中的 应用。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽及其制备方法和应用。一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽，其是从蚕蛹蛋白水解液中分离得到的血管紧张素转换酶抑制肽，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明的蚕蛹蛋白源血管紧张素转化酶抑制多肽具有结构新颖，分子量小，降血压活性高等特点，为治疗高血压的食品、药物和保健品的开发利用开辟了一条全新的途径，具有非常广泛的应用前景。
【IPC分类】C07K1/16, A23L33/00, A61P9/12, A61K38/08, C07K7/06, C12P21/06, C07K1/20, C07K1/34, C07K1/18, C07K1/36
【公开号】CN105237625
【申请号】CN201510726848
【发明人】赵钟兴, 王朝阳, 吕汶骏, 廖丹葵, 孙建华, 雷敬玲, 陶萌良, 王欣辉, 谢美萱
【申请人】广西大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月29日