一种低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化方法，属于生物化学技术领 域。
【背景技术】
[0002] 抗生素的发现与应用挽救了不计其数的生命，同时也带来了巨大的社会效益和 经济效益。但近年来，在临床治疗中结构新颖的抗生素发现匾乏，抗药菌群迅猛发展，使 某些感染性疾病成为临床治疗的难题。抗菌肤自发现和研究至今，已被认为是现有抗生素 的最佳替代品，其研究及应用己成为生物制药领域中的研究热点。抗菌肤的研究之所以倍 受青睐是因为其本身具备的如下特点：1.相对分子质量较小；2.理化性质稳定；3.抗菌谱 广，尤其是对抗药菌有显著疗效；4.自身又不易产生耐药性。
[0003] 由于抗菌肤的天然资源有限，因而通过基因工程在微生物中直接别表达抗菌肽 基因成为获取抗菌肤的主要手段。基因工程的产品组成复杂，对产品的纯度要求较高，而且 在纯化的过程当中存在聚集变性的趋势，特别是一些低分子量的蛋白，比一般的蛋白纯化 难度要大。而通过加入一些保护剂，可以使蛋白避免降解，通过透析、20%的三羟甲基甘氨 酸一十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE)电泳凝胶电泳可以快速 有效的分离得到低分子量的蛋白。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于，提供一种低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化方法，该方法 根据编码牛乳铁蛋白肽LfcinB的氨基酸编码序列NO. 1和相应的核苷酸编码序列N0. 2， 构建表达载体pPIC9K-LfcinB，并将载体转化到毕赤酵母GS115宿主细胞，形成可表达 的重组细胞；培养宿主细胞，使其表达LfcinB抗菌肽；分离浓缩母液，加入蛋白抑制剂 及保护剂，经透析和20%的三羟甲基甘氨酸一十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Tricine-SDS-PAGE)电泳，获得纯度较高的目的蛋白，经检测具有较高的抑菌活性。
[0005] 本发明所述的一种低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化方法，该方法涉及牛乳铁 蛋白肽LfcinB的氨基酸编码序列NO.l:Ac-FKCRRWQWRMKKLGAP-NH2;牛乳铁蛋白肽LfcinB编码的核苷酸序列N0. 2 :上游 5'-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGA AATTGGGTGCTCCTTTTC-3' 下游 5'-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGC ACCCAATTTCTTCCA-3' ；具体操作按下列步骤进行：
[0006] 构建所述的牛乳铁蛋白肽的基因表达系统：
[0007]a、根据牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列Nol:Ac-FKCRRWQWRMKKLGAP-NH2;设 计相应的核苷酸序列No2 :上游 5'-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAAT TGGGTGCTCCTTTTC-3' 下游 5'-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACC CAATTTCTTCCA-3'，将牛乳铁蛋白肽LfcinB基因读码区的上游带有SnaBI的酶切位点， 下游带有Notl酶切位点；
[0008] b、先将片段装入pMD19T中，再经过酶切，将目的片段装入pPIC9K，得到构建好的 表达载体；
[0009]c、将构建好的表达载体转化到毕赤酵母中，筛选到阳性克隆，经PCR鉴定正确后， 进行培养；
[0010] d、筛选到的阳性克隆在50毫升BMGY培养，温度30°C，200rpm振荡培养吸光度 0D2。。为2-60D值，3000rpm离心5min，弃去培养基，用1升BMGY培养基重新培养，并加入甲 醇诱导表达目的蛋白；
[0011] 牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化：
[0012] e、培养72h，迅速将培养液置于冰上，冷冻离心后，收集上清液，用pH6. 8的磷酸缓 冲液重悬菌体，加入裂解酶100mg/100ml，室温保持30min，3000rmp离心，收集上清液，将两 次上清液合并，加入苯甲基磺酰氟1〇禮，用三氯乙酸沉淀法将表达上清液浓缩10倍，重新 用pH6. 8的磷酸缓冲液溶解，用20%的三羟甲基甘氨酸一十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝 胶电泳，检测到目的蛋白，溶解后的蛋白用l〇Kd的滤膜进行透析，目的蛋白进入溶液中，然 后将滤出液选用截留分子量为l〇〇〇Da的透析膜除去盐分而保留目的多肽。
[0013] 将纯化后获得的低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽采用平皿二倍稀释法测定抗菌活 性检测生物活性。
[0014] 本发明所述的一种低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化方法，该方法中提供牛乳 铁蛋白肽（LfcinB)氨基酸序列Nol:Ac-FKCRRWQWRMKKLGAP-NH2 ;及编码基因的核苷 酸序列No2 :上游 5'-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTC CTTTTC-3' 下游 5'-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTT CCA-3'，将基因其中LfcinB基因读码区的上游带有SnaBI的酶切位点，下游带有Notl酶 切位点。先将片段装入PMD19T中，再经过酶切，将目的片段装入pPIC9K;将构建好的表达 载体转化到毕赤酵母中GS115,G418筛选阳性克隆；
[0015] 筛选到的阳性克隆在50毫升BMGY培养，30°C，200rpm振荡培养0D200为2-60D， 3000rpm离心5min，弃去培养基，用1LBMGY培养基重新培养，并加入甲醇诱导表达目的蛋 白；
[0016] 培养72h，迅速将培养液置于冰上，冷冻离心后，收集上清液，用PH6. 8的磷酸缓冲 液重悬菌体，加入裂解酶100mg/100ml，室温保持30min，3000rmp离心，收集上清液，将两次 上清液合并，加入苯甲基磺酰氟（PMSF)lOmM，三氯乙酸（TCA)沉淀法将表达上清液浓缩10 倍，重新用含有2%β-巯基乙醇（v/v)的PH6.8的磷酸缓冲液溶解；用20%的三羟甲基甘 氨酸一十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE)电泳，检测到目的蛋 白；溶解后的蛋白用l〇Kd的滤膜进行透析，目的蛋白进入溶液中，然后将滤出液选用截留 分子量为l〇〇〇Da的透析膜除去盐分而保留目的多肽，多肽检测抑菌活性，对大肠杆菌和金 色葡萄球菌有明显的抑制作用。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明pPIC9K-LfcinB表达载体构建图；
[0018] 图2为本发明pPIC9K-LfcinB阳性克隆酶切检测图；
[0019] 图3为本发明pPIC9K-LfcinB阳性克隆的PCR检测图；
[0020] 图4为本发明LfcinB的三羟甲基甘氨酸一十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电 泳（Tricine-SDS-PAGE)检测图。
【具体实施方式】
[0021] 实施例
[0022] 构建所述的牛乳铁蛋白妝的基因表达系统：
[0023] a、根据牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列Nol:Ac-FKCRR WQWRM KKLGA P-NH2;设 计相应的核苷酸序列No2 :上游 5'-TCA AAT GCT GGC GTT GGC AGT GGC GTT GGA AGA AAT TGG GTG CTC CTT TTC-3'下游 5'-GAA AGC ACG ACG CAC GCA AGT GAT AGA AGG AGC ACC CAA TTT CTT CCA-3'，将牛乳铁蛋白肽LfcinB基因读码区的上游带有SnaB I的酶切位点， 下游带有Notl酶切位点；
[0024]b、先将片段装入pMD19T中，再经过酶切，将目的片段装入pPIC9K，得到构建好的 表达载体；
[0025]c、将构建好的表达载体转化到毕赤酵母中，筛选到阳性克隆，经PCR鉴定正确后， 进行培养；
[0026]d、筛选到的阳性克隆在50毫升BMGY培养，温度30°C，200rpm振荡培养吸光度 0D2。。为2-60D值，3000rpm离心5min，弃去培养基，用1升BMGY培养基重新培养，并加入甲 醇诱导表达目的蛋白；
[0027] 牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化：
[0028]e、培养72h，迅速将培养液置于冰上，冷冻离心后，收集上清液，用pH6. 8的磷酸缓 冲液重悬菌体，加入裂解酶lOOmg/lOOml，室温保持30min，3000rmp离心，收集上清液，将 两次上清液合并，加入苯甲基磺酰氟（PMSF)lOmM，用三氯乙酸沉淀法将表达上清液浓缩10 倍，重新用PH6. 8的磷酸缓冲液溶解，用20%的三羟甲基甘氨酸一十二烷基硫酸钠一聚丙 烯酰胺凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE)胶电泳，检测到目的蛋白，溶解后的蛋白用10Kd的滤 膜进行透析，目的蛋白进入溶液中，然后将滤出液选用截留分子量为l〇〇〇Da的透析膜除去 盐分而保留目的多肽。
[0029] 将纯化后获得的低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽采用平皿二倍稀释法测定抗菌活 性检测生物活性。见表1 :
[0030] 表1纯化后的LfcinB抑菌活性检测
[0031]
[0032] 从表中可以看出，产物未经纯化时，抗菌活性低，纯化后，抗菌活性提高。从上表还 可以看出，对目前临床上产生抗药性的菌株（1515,12-8)有很好的抑制活性。
【主权项】
1. 一种低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化方法，其特征在于该方法涉及牛乳铁蛋白 肽LfcinB的氨基酸编码序列NO. I :Ac-FKCRR WQWRM KKLGA P-NH 2 ;牛乳铁蛋白肽LfcinB 编码的核苷酸序列 NO. 2 :上游 5'-TCA AAT GCT GGC GIT GGC AGT GGC GIT GGA AGA AAT TGG GTG CTC CTT TTC-3'下游 5'- GAA AGC ACG ACG CAC GCA AGT GAT AGA AGG AGC ACC CAA TTT CTT CCA-3' ；具体操作按下列步骤进行： 构建所述的牛乳铁蛋白肽的基因表达系统： a、 根据牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列Nol : Ac-FKCRR WQWRM KKLGA P-NH 2 ;设计 相应的核苷酸序列 No2 :上游 5' -TCA AAT GCT GGC GIT GGC AGT GGC GIT GGA AGA AAT TGG GTG CTC CTT TTC-3'下游 5'- GAA AGC ACG ACG CAC GCA AGT GAT AGA AGG AGC ACC CAA TTT CTT CCA-3'，将牛乳铁蛋白肽LfcinB基因读码区的上游带有SnaB I的酶切位 点，下游带有NotI酶切位点； b、 先将片段装入PMD19T中，再经过酶切，将目的片段装入pPIC9K，得到构建好的表达 载体； c、 将构建好的表达载体转化到毕赤酵母中，筛选到阳性克隆，经PCR鉴定正确后，进行 培养； d、 筛选到的阳性克隆在50毫升BMGY培养，温度30°C，200rpm振荡培养吸光度OD2。。为 2-60D值，3000rpm离心5min，弃去培养基，用1升BMGY培养基重新培养，并加入甲醇诱导表 达目的蛋白； 牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化： e、 培养72h，迅速将培养液置于冰上，冷冻离心后，收集上清液，用pH6. 8的磷酸缓冲 液重悬菌体，加入裂解酶100mg/100ml，室温保持30min，3000rmp离心，收集上清液，将两次 上清液合并，加入苯甲基磺酰氟1〇禮，用三氯乙酸沉淀法将表达上清液浓缩10倍，重新用 PH6. 8的磷酸缓冲液溶解，用20%的三羟甲基甘氨酸一十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶 电泳，检测到目的蛋白，溶解后的蛋白用IOKd的滤膜进行透析，目的蛋白进入溶液中，然后 将滤出液选用截留分子量为1000 Da的透析膜除去盐分而保留目的多肽。
【专利摘要】本发明涉及一种低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化方法，该方法根据编码牛乳铁蛋白肽LfcinB的氨基酸编码序列NO.1和核苷酸编码序列NO.2，构建表达载体pPIC9K-LfcinB，并将载体转化到毕赤酵母GS115宿主细胞，形成可表达的重组细胞；培养宿主细胞，使其表达LfcinB抗菌肽；分离浓缩母液，加入蛋白抑制剂及保护剂，经透析和20%的三羟甲基甘氨酸—十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得纯度较高的目的蛋白，经检测具有较高的抑菌活性。
【IPC分类】C07K1/36, C07K1/30, C07K7/08, C07K1/34, C07K1/26, C12N15/81
【公开号】CN105237627
【申请号】CN201510686691
【发明人】李晓波, 王亮, 肖向文, 李艳红
【申请人】中国科学院新疆理化技术研究所
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月21日