专利名称：乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和纯化方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的纯化方法，特别是一种乳铁蛋白的亲 和分离材料和乳铁蛋白的亲和的纯化方法。
背景技术：
乳铁蛋白又名乳转铁蛋白，是一种分子质量为70 80kDa的糖蛋白，属于转铁 蛋白家族成员，广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中(包括泪液、 精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞)。除参与铁代谢外，乳铁蛋 白及其蛋白降解产物一乳铁蛋白肽还具有广泛的生物学活性，包括广谱抗菌和抗病 毒活性，抑制肿瘤细胞生长，调节机体免疫反应和抗炎症，抗氧化作用，作为细胞 生长因子等，被认为是一种新型抗菌、抗病毒、抗癌药物和极具潜力的食品、化妆 品和饲料添加剂。美国食品药品管理局早已允许乳铁蛋白作为食品添加剂用于运 动、功能性食品。
目前乳铁蛋白主要来源于哺乳动物乳汁(如牛乳，羊奶和人乳)和利用基因工 程技术在真菌、植物和乳腺组织中表达乳铁蛋白产物。
经对现有技术文献的检索发现，从乳清中制备乳铁蛋白的方法主要为阳离子交 换层析，如中国专利200410080264 "牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化技术"，中国 专利200710102035 "—种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法"；由于单用 阳离子交换色谱纯化乳铁蛋白回收率低且纯度有限，中国专利"200610040528 —种 从牛初乳中工业化分离纯化乳铁蛋白的方法"将膜分离技术和工业色谱技术相结合， 先将乳清经分步超滤获得乳铁蛋白粗制品，再经强阳离子交换得乳铁蛋白精制品。 该纯化方法步骤较多，操作复杂且成本高，使得工业化应用受限。中国专利03152940 "牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯工艺方法"利用肝素一琼脂糖亲和层析柱从牛初乳
中分离纯化乳铁蛋白，该法获得产品纯度高，但得率较低且生产成本较高。因此，有必要开发效率高、成本低、生产步骤更简便的乳铁蛋白分离材料和和生产工艺。
发明内容
本发明的目的在于克服乳铁蛋白生产现有纯化技术的缺点，提供一种乳铁蛋白 的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和的纯化方法，能够快速、简便、低成本、大批量 纯化乳铁蛋白。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明的纯化方法，即仿生亲和纯化技术， 以专一性地识别乳铁蛋白作为基础，其步骤如下
第一步，在基础层析介质上进行固相合成，制备仿生亲和分离材料；
合成乳铁蛋白专一的亲和分离材料，首先以带氨基的基础层析介质，或用常规 化学方法对基础层析介质进行衍生化，带上氨基，与三氯三氮嗪反应活化，再与Beta-丙氨酸或l-氨基环己垸甲酸反应，合成亲和分离材料。
第二步，用制备的仿生亲和分离材料纯化乳铁蛋白。
用上述合成的亲和分离材料制备成亲和层析柱,将乳清样品流经该亲和层析柱， 乳铁蛋白吸附在亲和层析柱上，未结合的其它蛋白被洗去，改变缓冲液条件将结合 的乳铁蛋白洗脱下来，得到乳铁蛋白粗品。
第二步中，所述用制备的仿生亲和分离材料纯化乳铁蛋白，其中亲和介质吸附 乳铁蛋白的条件为pH 6.0-7.5， NaCl浓度为O.O-O. 2M的缓冲液；洗脱条件为pH 2. 0-3. 0, NaCl浓度为O-O. 15M的缓冲液。
所述的仿生亲和分离材料的配体中含有三氮嗪和Beta-丙氨酸或1-氨基环己垸 甲酸的结构。
所述的乳铁蛋白，其原料为牛乳、羊乳、人乳和含重组人乳铁蛋白的转基因牛 乳中一种。
本发明仿生亲和分离材料结构是通过三氮嗪结构骨架作为间臂固定Beta-丙氨 酸或1-氨基环己烷甲酸基团。本发明克服了乳铁蛋白生产技术中的缺点，在纯化乳 铁蛋白时步骤少，生产成本低，生产效率高，利用乳铁蛋白专一的亲和分离材料， 可快速、简便、低成本、大批量纯化乳铁蛋白。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进 行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下 述的实施例。
实例l:
一分离材料制备
取NH厂S印harose (500ml)，依次用5倍体积的1 M NaCl， IO倍体积蒸馏水充分 洗涤后，抽干转移至反应器皿中，在冰水浴中加入丙酮溶解的三氯三氮嗪〔100g)， 搅拌下用饱和NaHC03调节pH在6 ~ 7之间，反应3小时后取出，依次用3X10倍体积的 水/丙酮(0:l， 1:3， 1:1， 3:1， l:O)洗涤，得到1-氨基-S印harose-3， 5-二氯-2, 4, 6-三氮嗪(450ml)。
称取Beta-丙氨酸(100g)用去离子水(300 ml)溶解，与l-氨基-S印harose -3， 5-二氯-2, 4， 6-三氮嗪(300 ml)混匀，用饱和NaHC(Vf呆持pH在6. 5 8. 0之间， 置于5(TC下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的lMNaCl， IO倍体积蒸 馏水充分洗涤，得到l一氨基-S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4, 6_三氮嗪 (260 ml)，用30%乙醇储存待用。
二.转基因牛乳中重组人乳铁蛋白亲和纯化
取-7(TC冻存的转基因牛乳样品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm离心30niin， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至6.0，以饱和NaCl溶液调电导率至4. 85ms/cm，上样至预先用IO 倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH6. 0，电导率4. 85ms/cm)平衡好的装有按 实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4， 6-三氮嗪亲 和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH 6. 0, 电导率4. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基线，用甘氨酸一盐酸缓冲液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分析重组人乳铁蛋白纯度为75呢。
实例2:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，40。C水浴融化，4。C下4500rpm离心3(Mn，
取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4°C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至5. 6ras/cm,上样至预先用 lO倍体积Tris-HCl缓冲液(50 mM Tris， pH 7.0，电导率5. 6ms/cm)平衡好的装有 按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4, 6-三氮嗪 亲和分离材料的层析柱(1 x 5 cm)中，依次用Tris-HCl缓冲液(50mMTris， pH 7. 0， 电导率5. 6ms/cm)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸一盐酸缓冲液(O. 1M Gly， pH 2. 4) 洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分析重组人乳铁蛋白纯度为85. 1%。 实例3:
取-70'C冻存的转基因牛乳样品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm离心30min， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7. 5，以饱和NaCl溶液将其电导率调至6. Oms/cm,上样至预先用 lO倍体积Tris-HCl缓冲液(50 mM Tris， pH 7.5，电导率6. Oms/cm)平衡好的装有 按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4, 6-三氮嗪 亲和分离材料的层析柱(lx5cm)中，依次用Tris-HC1缓冲液(50mMTris， pH7.5， 电导率6. 0ms/cm)洗至280mn光吸收至基线，甘氨酸一盐酸缓冲液(0. 1MGly，pH 2.4) 洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分析重组人乳铁蛋白纯度为82y"
实例4:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，4(TC水浴融化，4。C下4500rpm离心30min， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4。C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至6. 85ms/cm，上样至预先用 10倍体积Tris-HC1缓冲液(50 mM NaCl, 50 mM Tris， pH 7.0，电导率6. 85ms/cm) 平衡好的装有按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2， 4， 6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1 x 5 cm)中，依次用Tris-HCI缓冲液(50 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，电导率6. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸一 盐酸缓冲液(0. 1M， pH 2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分析重组人 乳铁蛋白纯度为95%。
实例5: 取-70'C冻存的转基因牛乳样品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm离心30min， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4'C, 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9. 30ms/cm,上样至预先用 lO倍体积Tris-HCl缓冲液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，电导率9. 30ms/cm) 平衡好的装有按实例l步骤一制备的l-氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2， 4， 6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC].缓冲液(100 mMNaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，电导率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基线，甘氨 酸一盐酸缓冲液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分 析重组人乳铁蛋白纯度为96. 6%。
实例6:
取-7(TC冻存的转基因牛乳样品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm离心30rain， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6, 4'C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至13. 20ms/cm，上样至预先 用10倍体积Tris-HCl缓冲液(150mMNaCl,50mMTris， pH 7. 0,电导率13. 20ms/cm) 平衡好的装有按实例l步骤一制备的l-氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2， 4, 6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1 x 5 cm)中，依次用Tris-HCl缓冲液(150mM NaC1，50 raM Tris， pH 7.0，电导率13. 20ms/cm)洗至280咖光吸收至基线，甘氨酸 一盐酸缓冲液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分析 重组人乳铁蛋白纯度为96%。
实例7.-
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm离心30min, 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9. 30ms/cm，上样至预先用 10倍体积Tris-HC1缓冲液(100 mM NaCl， 50慮Tris， pH 7.0，电导率9. 30ms/cra) 平衡好的装有按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2, 4， 6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HCl缓冲液(100 mMNaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，电导率9. 30ms/cm)洗至280皿光吸收至基线，甘氨
酸一盐酸缓冲液(0. 1M Gly， pH 2.0)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分 析重组人乳铁蛋白纯度为83%。 实例8:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm离心30min， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4°C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9. 30ms/cm，上样至预先用 lO倍体积Tris-HCl缓冲液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，电导率9. 30ms/cm) 平衡好的装有按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一 2,4,6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HCl缓冲液(100 raMNaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，电导率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基线，甘氨 酸一盐酸缓冲液(0. 1M Gly， pH 3.0)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分 析重组人乳铁蛋白纯度为83. 5%。
实例9:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，40。C水浴融化，4。C下4500rpm离心30min， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4°C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9. 30ms/cm，上样至预先用 lO倍体积Tris-HCl缓冲液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，电导率9. 30ms/cm) 平衡好的装有按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2,4,6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HCl缓冲液(100 mMNaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，电导率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基线，甘氨 酸一盐酸缓冲液(0.05MNaC1，0. lMGly， pH 2. 4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以 SDS-PAGE分析重组人乳铁蛋白纯度为92呢。
实例10:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，40。C水浴融化，4'C下4500rpm离心30min， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4'C, 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9. 30ms/cm，上样至预先用 lO倍体积Tris-HCl缓冲液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，电导率9. 30ms/cm)
平衡好的装有按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC1缓冲液(100 mM NaCl， 50mM Tris， pH 7.0，电导率9. 30ms/cm)洗至280nra光吸收至基线，甘氨 酸一盐酸缓冲液(0. 1M NaCl， 0. lMGly， pH 2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以 SDS-PAGE分析重组人乳铁蛋白纯度为94. 5%。 实例ll:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，40。C水浴融化，4。C下4500rpm离心30min, 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4.6， 4°C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N Na0H调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9. 30ms/cm,上样至预先用 10倍体积Tris-HC1缓冲液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，电导率9. 30ms/cm) 平衡好的装有按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2， 4, 6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1 x 5 cm)中，依次用Tris-HC1缓冲液(lOOraM NaCl，50raMTris, pH 7. 0，电导率9. 30ms/cm)洗至280咖光吸收至基线，甘氨酸一 盐酸缓冲液(O. 15MNaC1,0. lMGly， pH 2. 4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE 分析重组人乳铁蛋白纯度为88. 2%。
实例12:
牛乳中牛乳铁蛋白的亲和纯化
取-70。C冻存的牛乳样品，4(TC水浴融化，4t:下4500rpm离心30min，取中间 层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4.6， 4°C， 12000rpm离心20min，取上清，以訓a0H 调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9. 30ms/cm，上样至预先用10倍体积 Tris-HC1缓冲液(lOOmM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，电导率9. 30ms/cm)平衡好的 装有按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4， 6_三 氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC1缓冲液(100mM NaCl, 50 mMTris， pH 7. 0，电导率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸一盐酸缓冲 液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分析，牛乳铁蛋 白纯度为85%。
实例13:
羊乳中羊乳铁蛋白的亲和纯化
取-70。C冻存的羊乳样品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm离心30min，取中间 层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4'C, 12000rpm离心20min，取上清，以lNNaOH 调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9. 30ms/cm,上样至预先用10倍体积 Tris-HC1缓冲液(100 mM NaCl, 50 mM Tris， pH 7. 0，电导率9. 30ms/cm)平衡好的 装有按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4， 6-三 氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HCl缓冲液(100mMNaCl， 50 mMTris， pH 7. 0，电导率9. 30ms/cra)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸—盐酸缓冲 液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分析，羊乳铁蛋 白纯度为87. 5%。
实例14:
人乳中乳铁蛋白亲和纯化
取-70。C冻存的人乳样品，40。C水浴融化，4。C下4500rpra离心30min，取中间 层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm离心20min,取上清，以lNNaOH 调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9. 30ms/cm，上样至预先用10倍体积 Tris-HC1缓冲液(100 raM NaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，电导率9. 30ms/cm)平衡好的 装有按实例l步骤一制备的l一氨基S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4， 6-三 氮嗪亲和分离材料的层析柱(lx5cm)中，依次用Tris-HC1缓冲液(100mMNaCl， 50 mMTris， pH7.0，电导率9. 30ms/cm)洗至280醒光吸收至基线，甘氨酸一盐酸缓冲 液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分析，人乳铁蛋 白纯度为84%。
实例15:
一分离材料制备
取冊2-S印harose (500ml)，依次用5倍体积的1 MNaCl， 10倍体积蒸馏水充分 洗涤后，抽干转移至反应器皿中，在冰水浴中搅拌下加入预冷丙酮溶解的三氯三氮 嗪(100 g)，用饱和NaHC03保持pH在6 7之间，反应3小时后取出，依次用3X10 倍体积的水/丙酮(0:1， 1:3， 1:1， 3:1， 1:0)洗涤，得到1-氨基-S印harose-3, 5-
二氯-2，4，6-三氮嗪(450ml )。
称取1-氨基环己烷甲酸(l-AMIN0 CYCLOHEXANE CARBOXYLIC ACID) (100 g)， 用去离子水(300 ml)溶解，与l-氨基-S印harose -3， 5-二氯_2， 4, 6-三氮嗪(300 ml) 混匀，用饱和NaHC(Vi周节pH在6. 5 8. 0之间，5CTC下搅拌反应24小时。反应结束后， 依次用3倍体积的lMNaCl， IO倍体积蒸馏水充分洗涤，得到1一氨基-S印harose — 3 一1-氨基环己烷甲酸一5 —氯一2，4，6-三氮嗪(260 ml),用30°/。乙醇储存待用。
二转基因牛乳中重组人乳铁蛋白亲和纯化
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，40。C水浴融化，4'C下4500rpm离心30min， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4°C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至5. 6ms/cm，上样至预先用 10倍体积Tris-HCl缓冲液(50 raM Tris， pH 7.0，电导率5. 6ms/cm)平衡好的装有 按实例14步骤一制备的1 一氨基S印harose — 3_ 1-氨基环己烷甲酸一5 —氯一2, 4， 6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC1缓冲液(50mMTris， pH7.0，电导率5. 6ras/cm)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸一盐酸缓冲液(0. lMGly， pH2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分析，重组人乳铁蛋白纯度为70%。
实例16:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm离心30min， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7. 5，以饱和NaCl溶液将其电导率调至6. Oms/cm，上样至预先用 10倍体积Tris-HCl缓冲液(50 mM Tris， pH 7.5，电导率6. Oms/cm)平衡好的装有 按实例14步骤一制备的1 一氨基S印harose — 3 — 1-氨基环己烷甲酸一5 —氯一2, 4, 6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC1缓冲液(50mMTris， pH7. 5，电导率6. 0ms/cm)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸一盐酸缓冲液(O. lMGly， pH2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE分析，重组人乳铁蛋白纯度为72%。
实例17:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，40。C水浴融化，4'C下4500rpm离心30min， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm离心20min，取上清，
以lNNaOH调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至6. 85ms/cm，上样至预先用 10倍体积Tris-HC1缓冲液(50 mM NaCl， 50 raM Tris, pH 7.0，电导率6. 85ms/cm) 平衡好的装有按实例14步骤一制备的l一氨基S印harose — 3—l-氨基环己垸甲酸一5 _氯一2，4,6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HCl缓冲 液(50mMNaCl，50raMTris， pH 7. 0，电导率6. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基线， 甘氨酸一盐酸缓冲液(0. lMGly， pH2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE 分析，重组人乳铁蛋白纯度为79.6%。 实例18:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，4CTC水浴融化，4。C下4500nM离心30min， 取中间层脱脂乳，以lNHCl调节pH值至4.6， 4°C， 12000rpm离心20min，取上清， 以lNNaOH调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9. 30ms/cm，上样至预先用 lO倍体积Tris-HCl缓冲液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，电导率9. 30ms/cm) 平衡好的装有按实例14步骤一制备的l一氨基S印harose — 3—l-氨基环己烷甲酸一5 一氯一2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC1缓冲 液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0,电导率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基 线，甘氨酸一盐酸缓冲液(0. 1M Gly， pH 2. 4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE 分析重组人乳铁蛋白纯度为84. 4%。
实例19:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，40。C水浴融化，4。C下4500rpm离心30min，取 中间层脱脂乳，以1N HCl调节pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm离心20rain，取上清， 以1N NaOH调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至13. 20ms/cm，上样至预先 用10倍体积Tris-HCl缓冲液(150mMNaCl， 50mMTris， pH 7. 0，电导率13. 20ms/cm) 平衡好的装有按实例14步骤一制备的1 一氨基S印harose — 3 — 1-氨基环己垸甲酸一 5 一氯一2,4,6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1 x 5 cm)中，依次用Tris-HC1缓冲 液(150函NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0,电导率13. 20ms/cm)洗至280画光吸收至 基线，甘氨酸一盐酸缓冲液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以 SDS-PAGE分析乳铁蛋白纯度为76. 3%。
实例20:
取-70。C冻存的转基因牛乳样品，4(TC水浴融化，4。C下4500rpm离心30min，取 中间层脱脂乳，以1N HCl调节pH值至4.6, 4'C， 12000rpm离心20min，取上清， 以1N NaOH调节pH至7. 0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至15. 90ms/cm，上样至预先 用10倍体积Tris-HCl缓冲液(200mMNaCl， 50mMTris， pH7. 0，电导率15. 90ms/cm) 平衡好的装有按实例14步骤一制备的1 一氨基S印harose — 3 _ 1-氨基环己垸甲酸_ 5 一氯一2，4,6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1 x 5 era)中，依次用Tris-HC1缓冲 液(200 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0,电导率15. 90ms/cm)洗至280ntn光吸收至基 线，甘氨酸一盐酸缓冲液(0. 1M Gly，pH 2. 4)洗脱结合的乳铁蛋白，收集后以SDS-PAGE 分析乳铁蛋白纯度为83%。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各 种改动或修改，如起始材料NH2-S印harose可以更换成葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、 烯丙基葡聚糖和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡 聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的 硅胶等，这些等价形式同样落于本发明的范围。
权利要求
1、一种乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和纯化方法，其特征在于，包括如下步骤第一步，合成乳铁蛋白专一的亲和分离材料首先以带氨基的基础层析介质，或用常规化学方法对基础层析介质进行衍生化，带上氨基，与三氯三氮嗪反应活化，再与Beta-丙氨酸或1-氨基环己烷甲酸反应，合成亲和分离材料；第二步，用制备的仿生亲和分离材料纯化乳铁蛋白。
2、 根据权利要求1所述的乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和纯化方 法，其特征是，所述基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖 和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共 聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶中一种。
3、 根据权利要求1所述的乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和纯化方法， 其特征是，所述用制备的仿生亲和分离材料纯化乳铁蛋白，是指用合成的亲和分离材料制备成亲和层析柱，将乳清样品流经该亲和层析柱，乳铁蛋白吸附在亲和层 析柱上，未结合的其它蛋白被洗去，改变缓冲液条件将结合的乳铁蛋白洗脱下来， 得到乳铁蛋白粗品。
4、 根据权利要求1或3所述的乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和纯化方 法，其特征是，所述用制备的仿生亲和分离材料纯化乳铁蛋白，其中亲和介质吸附 乳铁蛋白的条件为pH 6.0-7.5， NaCl浓度为0.0-0.2M的缓冲液。
5、 根据权利要求1或3所述的乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和纯化方 法，其特征是，所述用制备的仿生亲和分离材料纯化乳铁蛋白，其中亲和介质洗脱 条件为pH 2. 0-3. 0， NaCl浓度为O-O. 15M的缓冲液。
6、 根据权利要求1或3所述的乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和纯化 方法，其特征是，所述的仿生亲和分离材料的配体中含有三氮嗪和Beta-丙氨酸或 1-氨基环己烷甲酸的结构。
7、 根据权利要求1或3所述的乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和纯化方法，其特征是，所述的乳铁蛋白，其原料为牛乳，羊奶，人乳或含重组人乳铁蛋白 的转基因牛乳中一种。
全文摘要
本发明涉及一种生物医药技术领域的乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和纯化方法，包括步骤第一步，合成乳铁蛋白专一的亲和分离材料首先以带氨基的基础层析介质，或用常规化学方法对基础层析介质进行衍生化，带上氨基，与三氯三氮嗪反应活化，再与Beta-丙氨酸或1-氨基环己烷甲酸反应，合成亲和分离材料；第二步，用制备的仿生亲和分离材料纯化乳铁蛋白。本发明能够高效率、低成本的大规模生产高纯度的乳铁蛋白。
文档编号C07K1/22GK101362792SQ20081020042
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者任慧娟, 胜 文, 李荣秀, 霍晨晰, 黄飞云 申请人:上海交通大学