专利名称：牛乳铁蛋白肽及其制备方法
牛乳铁蛋白肽及其制备方法技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及牛乳铁蛋白肽及其制备方法。
背景技术：
抗生素作为抗菌和促生长添加剂在动物饲料中使用已经有很长的历史，但随着人们认识水平的提高，抗生素在动物饲料中的广泛使用暴露出越来越多的负面作用，其中最为严重的，一是能造成畜禽产品中的药物残留，直接影响消费者的身体健康；二是严重影响动物消化道的微生态平衡，造成一些病原菌耐药性的发生，使得针对由这些病原菌所引起的感染的预防和治疗变得非常困难。目前，细菌抗药性问题普遍存在，而且耐药菌株的数量也显著增加，一些原来威胁人类生命的疾病，比如肺结核等，重又开始大范围发生。丹麦是最早禁止在饲料中使用抗生素的国家，从1994年开始，逐步减少抗生素在饲料中的使用。 2003年，世界卫生组织(WHO)建议按照丹麦的模式逐步减少抗生素的使用。2006年，欧盟已经全面禁止抗生素在动物饲料中的使用。虽然我国还没有立法阻止抗生素作为饲料添加剂的使用，也在逐步减少使用量。但是，目前我国仍有20余种抗生素在动物饲料中使用。 随着我国加入WT0，抗生素的使用已经严重影响了我国畜牧业产品在国际市场上的竞争力。 因此，开发新型抗生素替代品对我国畜牧业的安全、健康、和谐发展越来越重要。
抗菌肽(antibacterial peptides)是指存在于生物体内具有抵抗外界病原微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽，它是动物免疫防御系统的一个重要组成部分。抗菌肽是由生物特定基因编码，具有广谱抗菌活性，尤其对耐药菌株有明显的杀灭作用，且不破坏生物体细胞，无免疫原性。抗菌肽可大致分为以下几类杀菌肽类 (cecropins)、富含脯氨酸残基的娃皮素(magainin)、富含甘氨酸的蜂毒素(melittin)、富含胱氨酸残基的防御素(defensin)和富含脯氨酸和精氨酸的cathelicidin族抗菌肽类。 抗菌肽具有高效抗细菌、真菌、病毒，甚至抗肿瘤活性，在农业和临床治疗上都有广阔的应用前景，是最具开发前景的抗生素替代品发明内容
本发明的目的是提供一种牛乳铁蛋白肽(Bovine Lactoferricin,简写为LfcinB) 及其制备方法，Lfcin B是所有Lfcin中活性最高的，抑菌效果是牛乳铁蛋白400倍，能在胃肠道中发挥更重要的作用。
本发明的目的是通过以下技术 方案来实现
牛乳铁蛋白肽的核苷酸序列为
GCTCCAAGAAAGAACGTTAGATGGTGTACTATTTCTCAACCAGAA
TGGTTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGT
GCTCCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTCGCTTTGGAATGT
ATTAGAGCTATTGCTGAGAAGAAGGCTGATCCTGTTACTTTGGAT
GGTGGTATGGTTTTCGAAGCTGGTAGAGATCCATACAAGTTGAGA
CCAGTTGCTGCTGAAATTTACGGTACTAAGGAATCTCCACAAACT
CATTACTACGCTGTTGCTGTTGTTAAGAAGGGTTCTAACTTTCAA
TTGGATCAATTGCAAGGTAGAAAGTCTTGTCATACTGGTTTGGGT
AGATT
其中牛乳铁蛋白肽核苷酸序列的活性中心为
TTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGTGCT
CCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTC
该牛乳铁蛋白妝的氣基酸序列为
aprknvrwctisqpewfkcrrwqwrmkklgapsitcvrrafaleciraiaggmvfeagrdpyklrpvaae iygtkespqt hyyavavvkk gsnfqldqlq grkschtglgr
其中牛乳铁蛋白肽氨基酸序列的活性部分为
fkcrrwqwrm kklgapsitc vrraf。
该序列共由365个碱基组成，其中，5’端信号肽包括48个碱基，3’端融合蛋白部分包括240个碱基，活性中心由75个碱基(从第49位到第123位)组成，编码具有序列表中的氨基酸序列的Bovine Lactoferricin蛋白，编码区中，A占28.1 % (102个)，C占 14. 3% (52个)，6占26.2% (95 个)，T 占 31. 4% (114 个)，A+T 占 59. 5% (216 个)，C+G 占 40. 5% (147 个)。
牛乳铁蛋白肽的制备方法包括以下步骤
1、重组表达载体的构建
1.1、牛乳铁蛋白肽基因的合成；
人工合成牛乳铁蛋白的前I 121氨基酸序列。
1. 2、牛乳铁蛋白妝基因的克隆；
人工合成一对引物，并在其5’端分别加上BamH I和Xho I酶切位点。上游引物及下游引物如下
Blf-F 5/ ~TATCGGATCCGCTCCAAGAAAGAACGTT~3/，
Blf-R 5/ ~GGTGCTCGAGTTATCTACCCAAACCAGTATG~3/。
1. 3、构建重组表达载体。
2、诱导表达融合蛋白
2.1、含牛乳铁蛋白肽基因的工程菌的获得；
2. 2、诱导表达融合蛋白。
3、蛋白质的分离与纯化
3.1、融合蛋白的分离；
3. 2、融合蛋白的浓缩；
3. 3、融合蛋白的纯化；
3. 4、牛乳铁蛋白肽的保存。
本发明的有益效果为
1、在水溶液中呈亲水脂的两个反向β折叠结构，具有耐热、在消化道不易被降解、无抗原性的特征，能调节免疫作用，具有广谱抗菌作用，不干扰肠道有益菌等特性；
2、其对许多G+和G-均有抗菌作用，如大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等，但不作用于双歧杆菌等对人体有益细菌、同时还能刺激细胞的生长、参与免疫调节；
3、由于其特殊的功能作用，作为饲料添加剂以食品防腐剂的开发研究，已经受到国内外研究机构和制造商的重视，成为研究热点。
具体实施方式
实施例基因工程生产牛乳铁蛋白肽
1、重组表达载体的构建
1. 1> Bovine Lactoferricin I 基因的合成
人工合成牛乳铁蛋白的前I 121氨基酸序列(下划线部分为牛乳铁蛋白肽(共 363bp，121个氨基酸)
GCTCCAAGAAAGAACGTTAGATGGTGTACTATTTCTCAACCAGAA
TGGTTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGT
GCTCCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTCGCTTTGGAATGT
ATTAGAGCTATTGCTGAGAAGAAGGCT GATGCTGTTACTTTGGAT
GGTGGTATGGTTTT°C GAAGCTGGTAGAGATCCATACAAGTTGAGA
CCAGTTGCTGCTGAAATTTACGGTACTAAGGAATCTCCACAAACT
CATTACTACGCTGTTGCTGTTGTTAAGAAGGGTTCTAACTTTCAA
TTGGATCAATTGCAAGGTAGAAAGTCTTGTCATACTGGTTTGGGT
AGA TT
保存于pUC19/T0P10 中。
1. 2> Bovine Lactoferricin I 基因的克隆
人工合成一对引物，并在其5’端分别加上BamH I和Xho I酶切位点。上游引物及下游引物如下
Blf-F 5/ -TATCGGATCCGCTCCAAGAAAGAACGTT-3'，
Blf-R 5/ ~GGTGCTCGAGTTATCTACCCAAACCAGTATG~3/。
以上述Blf-F和Blf-R为引物，以人工合成牛乳铁蛋白的前I 121氨基酸序列为模板进行PCR扩增；扩增体系为10 X buffer 2. 5 μ L，dNTPmix (IOmM) 2 μ L， MgCl2 (25mM)1. 5 μ L, Blf-F primer (10 μ Μ)I μ L, Blf-R primer (10 μ Μ)I μ L, TaKaRa pfu-Taq (5u) O. 25 μ L，模板25ng，用灭菌双蒸水补足至25. O μ L ;扩增程序为94°C预变性 5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s，共35个循环，最后在72°C下延伸lOmin。
PCR扩增得到378bp的片段，将得到的PCR产物回收，连接pMD18_T克隆载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)，得到重组载体pMD18-T_Bovine Lactoferricin I,然后将该重组载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，然后对阳性克隆用BamH I与Xho I双酶切鉴定，鉴定正确后送Invitrogen公司测序。
1. 3、构建重组表达载体
将上述步骤1. 2 得到的 pMD18-T_Bovine Lactoferricin I 用 BamH I 与 Xho I 双酶切，得到的含Bovine Lactoferricin I基因的片段与经同样双酶切的pET30a(+)表达载体相连接，得到 pET30a(+)-Bovine Lactoferricin I。
2、诱导表达融合蛋白
2.1、含牛乳铁蛋白肽基因的工程菌的获得
I)用电击法将步骤I中步骤1. 3的重组表达载体pET30a(+)-Bovine Lactoferricin I转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中(购于德国默克公司)。
其中电击法的步骤如下取出-70°C保存的大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞， 冰浴融化；取80ul的Rosetta(DE3)感受态细胞,加入已连接好的重组表达载体,于O. 5ml 冰冷的微量无菌离心管中混匀，置于冰上5min (使感受态细胞与质粒充分接触)，然后迅速将混合液体加入已灭菌的干净的电转化杯中，轻击液体以确保细菌与DNA悬液位于电击杯底部。擦干电击槽外的冷凝水和雾气，将电击杯放进电击仪，按设定的参数，启动对细胞的电脉冲。电击完立即快速加入800ul的LB培养液，然后吸出液体装入1. 5ml离心管中，放入37°C、150r/min摇床培养1. 5h。吸取50ul的培养菌液铺板(含氨苄青霉素，其终浓度为 50 100ug/ml ;含氯霉素，其终浓度为34ug/ml的LB培养平板)，37°C培养过夜14h (先正面放半小时，让培养液被琼脂完全吸收，再反面培养过夜)。
2)阳性转化子的筛选及鉴定从LB平板上挑取5-8个具氨苄青霉素和氯霉素2种抗性的单克隆菌落，接种到含50-100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的3ml LB液体培养基中，250rpm 37°C振荡培养14h。取1-2 μ I菌液为模板，以步骤I中的Blf-F和Blf-R为引物，进行PCR扩增，鉴定大肠杆菌中是否含有目的基因片段，PCR扩增反应条件及热循环设置同步骤1，结果表明，该菌株中含有目的基因片段。然后提取该菌株中的质粒，用BamH I与Xho I对其进行双酶切检测，结果表明酶切条带中含有与扩增基因大小一致的条带，说明pET30a(+)-Bovine Lactoferricin I重组表达载体已成功转入大肠杆菌Rosetta (DE3) 细胞中。
2. 2、诱导表达融合蛋白
取阳性单克隆菌株接种于20ml的LB培养液(含氨苄青霉素，其终浓度为50 100ug/ml ;含氯霉素，其终浓度为34ug/ml)中，37°C、250r/min摇床过夜培养14 16h。按 I %接种菌液于新的LB液体培养基进行表达即吸取200ul菌液，接种于20ml新的LB培养液(含氨苄青霉素，其终浓度为50 lOOug/ml ;含氯霉素，其终浓度为34ug/ml)中，37°C、 250r/min摇床培养约2h，至OD600 = O. 4 O. 6时，每个样品吸取1. Oml于4°C保存，作为初始样品对照；然后加入IPTG进行诱导表达。加入IPTG使其终浓度达0. 4mg/ml，然后将培养液置于16°C、250r/min摇床培养，分别于16_18h收取菌液于50ml离心管中。4°C，8000xg， 离心lOmin，弃上清，加入1. Oml预冷(4°C )的PBS完全重悬沉淀，洗涤菌体；4°C,8000xg, 离心IOmin,弃上清,收集菌体细胞,称湿重；按Ig 5ml的比例加入纯水重悬沉淀,_80°C, 冻15min ； 100°C,煮5min反复冻煮2 3次后加入5 X Loading Buffer,最大转速离心3min 后，取上清进行SDS-PAGE检测，蛋白质电泳结果表明含有牛乳铁蛋白肽的融合蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中大量表达，其表达量约占菌体蛋白总量的35%。
3、蛋白质的分离与纯化
3.1、融合蛋白的分离
待菌体37°C诱导培养3小时后，4°C，8000Xg离心收集菌体。用生理盐水洗涤菌体后，4°C，8000Xg离心收集菌体，称菌体湿重。然后按菌体湿重Ig IOml的比例加入裂解液重悬菌体。超声波破碎细胞，用DNase I和RNase A酶处理核酸后，4°C，10000X g离心，收集上清液，可溶性融合蛋白即存在于上清液中。
3. 2、融合蛋白的浓缩
用0°C时，饱和度为65%的硫酸铵浓缩上清中融合蛋白，使其浓缩比为10 I。然后用Bradford法测定浓缩液中蛋白质浓度。
3. 3、融合蛋白的纯化
由于融合蛋白在N端含有His-tag标签蛋白，所以第一步用Ni2+-1MAC亲和层析法纯化融合蛋白。所用填料为Bio-Rad公司的IMAC聚丙烯酰胺介质，层析柱规格为1. 5mmX IOcm,在层析过程中所用填料为IOml,其动态载量为4mg蛋白/ml填料,层析最大流速为 3ml/min。
收集洗脱峰，然后调节洗脱液的PH值至2.0，按质量比为3%的量在洗脱液中加入胃蛋白酶P印sin I 10000，37°C孵育I小时，使其充分切割标签蛋白还原天然乳铁蛋白肽，然后72°C热处理15min，终止反应，，调节反应液PH至7. O。
由于乳铁蛋白肽属于小分子肽，分子量为3. lKDa，而融合标签蛋白的分子量为 IOKDa,故两者分子 量的差异采用凝胶过滤层析法分离切割后天然肽片段和融合标签，收集洗脱峰，收集乳铁蛋白肽。
3. 4、乳铁蛋白肽的保存
将洗脱液经透析处理后进行冷冻干燥处理，收集乳铁蛋白肽冻干粉末，于4°C长期保存。
序列表牛乳铁蛋白肽的核苷酸序列为GCT CCA AGA AAG AAC GTT AGA TGG TGT ACT ATT TCT CAA CCA GAA TGG TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGT GCT CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC GCT TTG GAA TGT ATT AGA GCT ATT GCT GAG AAG AAG GCT GAT GCT GTT ACT TTG GAT GGT GGT ATG GTT TTC GAA GCT GGT AGA GAT CCA TAC AAG TTG AGA CCA GTT GCT GCT GAA ATT TAC GGT ACT AAG GAA TCT CCA CAA ACT CAT TAC TAC GCT GTT GCT GTT GTT AAG AAG GGT TCT AAC TTT CAA TTG GAT CAA TTG CAA GGT AGA AAG TCT TGT CAT ACT GGT TTG GGT AGATT
权利要求
1.一种牛乳铁蛋白肽，其特征在于，该牛乳铁蛋白肽的核苷酸序列为GCT CCA AGA AAG AAC GTT AGA TGG TGT ACT ATT TCT CAA CCA GAATGG TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGTGCT CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC GCT TTG GAA TGTATT AGA GCT ATT GCT GAG AAG AAG GCT GAT GCT GTT ACT TTG GATGGT GGT ATG GTT TTC GAA GCT GGT AGA GAT CCA TAC AAG TTG AGACCA GTT GCT GCT GAA ATT TAC GGT ACT AAG GAA TCT CCA CAA ACTCAT TAC TAC GCT GTT GCT GTT GTT AAG AAG GGT TCT AAC TTT CAATTG GAT CAA TTG CAA GGT AGA AAG TCT TGT CAT ACT GGT TTG GGTAGA TT 该牛乳铁蛋白妝的氣基酸序列为 aprknvrwct isqpewfkcr rwqwrmkklg apsitcvrra faleciraia ekkadavtldggmvfeagrdpyklrpvaae iygtkespqt hyyavavvkk gsnfqldqlq grkschtglgr。
2.根据权利要求1所述的牛乳铁蛋白肽，其特征在于，所述牛乳铁蛋白肽核苷酸序列的活性中心为TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGT GCTCCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC该牛乳铁蛋白肽氨基酸序列的活性中心为fkcrrwqwrm kklgapsitc vrraf。
3.权利要求1或2所述的牛乳铁蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)重组表达载体的构建； 2)诱导表达融合蛋白； 3)蛋白质的分离与纯化。
4.根据权利要求3所述的牛乳铁蛋白肽的制备方法，其特征在于所述步骤I)包括 牛乳铁蛋白肽基因的合成； 牛乳铁蛋白妝基因的克隆； 构建重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的牛乳铁蛋白肽的制备方法，其特征在于所述步骤2)包括 含牛乳铁蛋白肽基因的工程菌的获得； 诱导表达融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的牛乳铁蛋白肽的制备方法，其特征在于所述步骤3)包括 融合蛋白的分离； 融合蛋白的浓缩； 融合蛋白的纯化； 牛乳铁蛋白肽的保存。
全文摘要
本发明涉及牛乳铁蛋白肽及其制备方法，牛乳铁蛋白肽(Bovine Lactoferricin，简写为Lfcin B)是经胃蛋白酶从牛乳铁蛋白(bLF)N-端(17～41)水解的25个氨基酸残基，分子量约为3.1kd；其制备方法包括1)重组表达载体的构建；2)诱导表达融合蛋白；3)蛋白质的分离与纯化。本发明的有益效果为Lfcin B是所有Lfcin中活性最高的，抑菌效果是牛乳铁蛋白400倍，能在胃肠道中发挥更重要的作用。
文档编号C12N15/63GK102993296SQ201110272178
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者夏新界, 李圣翔 申请人:广州格拉姆生物科技有限公司