专利名称：用于鉴别水稻粳亚种生态型的引物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于鉴别水稻粳亚种生态型的引物组合物及其应用。
背景技术：
栽培稻的分类一直受到各国科学家的高度重视，国内外学者相继提出了多种分类体系。籼、粳是亚洲栽培稻遗传分化的主流，已有了比较一致的认识。每个亚种内的遗传分化及分类却一直没有一致的意见。进入20世纪80年代以来，我国杂交稻产量徘徊不前，其中最主要的原因是亲本的遗传基础狭窄，而拓宽杂交稻亲本间的遗传差异，可以在一定程度上提高组合的优势强度。 然而，根据不同地区的生态条件所划分的生态类型无法有效反映亲本间的遗传差异，对杂种优势的预测效果不理想。另外，水稻中籼、粳亚种间杂种优势的利用已得到广泛的关注， 但是，由于存在Fl代半不育等诸多问题，亚种间杂种优势一直难以直接利用，亚种内不同生态类型间的杂种优势利用已成为育种家的共识。但是，有关合理、可行的亚种内生态型的划分研究较少。亚种内不同生态型间杂种优势的利用已成为杂交稻进入更高发展阶段，开展超高产育种的一个主要方向。要进行粳稻亚种内不同生态型间杂种优势的超高产育种，首先要正确判别能够反映品种间遗传差异的生态型。然而，大量育成品种由于广泛杂交而具有复杂的血缘，对这些品种的分类是栽培稻分类的新任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴别水稻粳亚种生态型的引物组合物及其应用。本发明提供的辅助鉴别水稻粳亚种生态型的引物组合物，由RM335引物对、RM5引物对、RM81a引物对、RM42引物对、RM255引物对、RM134引物对、RM223引物对、RM253引物对和RM258引物对组成；所述RM335引物对为序列表的序列1所示DNA(上游引物)和序列表的序列2所示DNA (下游引物)组成的引物对；所述RM5引物对为序列表的序列3所示DNA (上游引物) 和序列表的序列4所示DNA (下游引物)组成的引物对；所述RMSla引物对为序列表的序列 5所示DNA(上游引物)和序列表的序列6所示DNA(下游引物)组成的引物对；所述RM42 引物对为序列表的序列7所示DNA (上游引物)和序列表的序列8所示DNA (下游引物)组成的引物对；所述RM255引物对为序列表的序列9所示DNA (上游引物)和序列表的序列10 所示DNA (下游引物)组成的引物对；所述RM134引物对为序列表的序列11所示DNA (上游引物)和序列表的序列12所示DNA(下游引物)组成的引物对；所述RM223引物对为序列表的序列13所示DNA (上游引物)和序列表的序列14所示DNA (下游引物)组成的引物对；所述RM253引物对为序列表的序列15所示DNA (上游引物)和序列表的序列16所示DNA (下游引物)组成的引物对；所述RM258引物对为序列表的序列17所示DNA(上游引物)和序列表的序列18所示DNA(下游引物)组成的引物对。
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所述水稻粳亚种生态型可为水粳生态型、中间型生态型或陆粳生态型。所述引物组合物中的每条引物在合成时，可以引入各种标记，如荧光标记。所述的引物组合物可用于辅助鉴别水稻粳亚种生态型。所述水稻粳亚种生态型可为水粳生态型、中间型生态型或陆粳生态型。所述的引物组合物可用于制备辅助鉴别水稻粳亚种生态型的试剂盒。所述水稻粳亚种生态型可为水粳生态型、中间型生态型或陆粳生态型。本发明还保护一种辅助鉴别水稻粳亚种生态型的试剂盒，含有所述引物组合物。 所述水稻粳亚种生态型可为水粳生态型、中间型生态型或陆粳生态型。所述试剂盒中，还可包括用于提取基因组DNA的试剂和/或用于PCR扩增的试剂。所述试剂盒中的各个组分可为液体，也可为冻干粉。本发明还保护一种应用所述引物组合物辅助鉴别水稻粳亚种生态型的方法，所述水稻粳亚种生态型为水粳生态型、中间型生态型或陆粳生态型，所述方法包括如下步骤(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，分别用所述RM335引物对、所述RM5引物对、 所述RM81a引物对、所述RM42引物对、所述RM255引物对、所述RM134引物对、所述RM223 引物对、所述RM253引物对和所述RM258引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(2)检测采用各个所述引物对得到的所述PCR扩增产物，按照如下标准进行赋值采用所述RM335引物对，如果得到IMbp的PCR扩增产物RM335_115 = 1，如果没有得到115bp的PCR扩增产物RM335_115 = 0 ；采用所述RM5引物对，如果得到114bp的PCR扩增产物、RM5_114 = 1，如果没有得到 114bp 的 PCR 扩增产物、RM5_114 = 0 ；采用所述RM81a引物对，如果得到116bp的PCR扩增产物、RM81a_116 = 1，如果没有得至Ij 116bp的PCR扩增产物、RM81a_116 = 0 ；采用所述RM42引物对，如果得到165bp的PCR扩增产物、RM42_165 = 1，如果没有得到的PCR扩增产物、RM42_165 = 0 ；采用所述RM255引物对，如果得到150bp的PCR扩增产物、RM255_150 = 1，如果没有得到150bp的PCR扩增产物、RM255_150 = 0 ；采用所述RM134引物对，如果得到85bp的PCR扩增产物、RM134_85 = 1，如果没有得到^bp的PCR扩增产物、RM134_85 = 0 ；采用所述RM223引物对，如果得到的PCR扩增产物、RM223_155 = 1，如果没有得到155bp的PCR扩增产物、RM223_155 = 0 ；采用所述RM253引物对，如果得到140bp的PCR扩增产物、RM253_140 = 1，如果没有得至Ij 140bp的PCR扩增产物、RM253_140 = 0 ；采用所述RM258引物对，如果得到127bp或130bp的PCR扩增产物、RM258_127/130 =1，如果没有得到127bp且没有得到130bp的PCR扩增产物、RM258_127/130 = 0 ；(3)将步骤⑵得到的各个赋值代入如下判别式a = (0. 93*RM335_115+0. 87*RM5_114+0. 84*RM81a_116)/(0· 93+0. 87+0. 84)；b = (0. 99*RM223_155 + 0. 82*RM253_140 + 0. 99*RM258_ 1 27/ 1 30) / (0. 99+0. 82+0. 99)；c = (0. 84*RM42_165+0. 89*RM255_150+0. 85*RM134_85)/(0. 84+0. 89+0. 85)；
如果a > b且a > c，所述待测水稻为候选的水粳生态型；如果b > a且b > C，所述待测水稻为候选的中间型生态型；如果c > a且c > b，所述待测水稻为候选的陆粳生态型。采用所述RM335引物对进行所述PCR扩增的退火温度具体可为52°C。采用所述 RM5引物对进行所述PCR扩增的退火温度具体可为48°C。采用所述RMSla引物对进行所述 PCR扩增的退火温度具体可为50°C。采用所述RM42引物对进行所述PCR扩增的退火温度具体可为50°C。采用所述RM255引物对进行所述PCR扩增的退火温度具体可为48°C。采用所述RM134引物对进行所述PCR扩增的退火温度具体可为58°C。采用所述RM223引物对进行所述PCR扩增的退火温度具体可为50°C。采用所述RM253引物对进行所述PCR扩增的退火温度具体可为48°C。采用所述RM258引物对进行所述PCR扩增的退火温度具体可为 48 "C。采用所述各个引物对进行所述PCR扩增的反应体系均可为如下15 μ 1体系所述基因组 DNA(20ng/ μ 1)2. 5 μ 1, Taq polymerase (5u/ μ 1)0. 18 μ 1, IOXBuffer 1· 5 μ 1， MgC12(15mM/y 1)1. 5μ 1,所述上游引物(66ng/μ 1) 0. 7 μ 1，所述下游引物(66ng/ μ 1)0. 7 μ 1, dNTP(10mM/y 1)0. 18 μ 1, Η20 7. 74 μ L· 实施例中采用的是 15ul PCR 反应体系，本领域技术人员可以将反应体系扩大或缩小，也可以将引物含量增多或减少。采用所述各个引物对进行所述PCR扩增的反应程序均可如下95°C预变性5分钟； 95°C变性30秒，采用所述退火温度退火1分钟，72 °C延伸1分钟30秒，30个循环；72°C延伸10分钟。检测采用各个所述引物对得到的所述PCR扩增产物方法可为所述方法中可采用变性胶聚丙烯酰胺凝胶电泳。所述电泳中，优选采用银染法染色。检测采用各个所述引物对得到的所述PCR扩增产物的方法具体可为将所述PCR扩增产物进行8%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(优选采用70W恒功率进行电泳)，然后进行银染染色。检测采用各个所述引物对得到的所述PCR扩增产物的方法具体可为将所述PCR 扩增产物进行测序。所述方法中，可采用CTAB法提取待测水稻的基因组DNA。所述方法中，用于提取所述基因组DNA的水稻材料可为新鲜的，也可为干品。本发明基于水稻粳亚种内的3种生态型的DNA序列差异，提供了引物组合物，可用于水稻粳亚种中三种生态型的鉴定。基于所述引物组合物，本发明的发明人还提出了粳稻 3种主要生态型的典型特征等位变异及判别关系式。本发明采用419个水稻样本对本发明的引物组合物和方法进行了验证。所选用的材料有很好的代表性，为用SSR标记进行品种鉴别研究提供了很好的平台。与传统利用表型的鉴别方法相比，本发明提供的方法极大的缩短了鉴别时间；仅用粳稻各生态型特征等位变异，在苗期就可以完成鉴别，无需田间大面积种植，无鉴别时间限制和环境影响，省时省力，是一种简单、快速、稳定的鉴别水稻粳亚种内各生态型的方法。本发明具有快捷高效、灵敏度高、分辨力好、结果准确可靠等优点，适用于水稻品种的鉴定、水稻育种以及植物进化研究等方面的应用。本发明利用分子标记系统分析稻种质资源的遗传结构、演化，通过对粳稻种质资源的SSR分析，提出了粳稻亚种内的分类体系，为研究粳亚种内的生态型的鉴别方法奠定了基础，具有重要的理论意义和实践价值，对水稻分类及杂种优势的利用具有重要意义。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、引物组合物的制备各条引物的核苷酸序列如下RM335引物对(退火温度为52°C )上游引物5，-gtacacacccacatcgagaag-3‘(序列表的序列1)；下游引物5，-gctctatgcgagtatccatgg-3‘(序列表的序列2、；RM5引物对(退火温度为48°C )上游引物5，-tgcaacttctagctgctcga-3，(序列表的序列3)；下游引物5，-gcatccgatcttgatggg-3’(序列表的序列 4)；RM81a引物对(退火温度为50°C )上游引物5，-gagtgcttgtgcaagatcca-3，(序列表的序列5)；下游引物5，-cttcttcactcatgcagttc-3，(序列表的序列6)；RM42引物对(退火温度为50°C )上游引物5，-atcctaccgctgaccatgag-3，(序列表的序列7)；下游引物5’-tttggtctacgtggcgtaca-3’ (序列表的序列 8)；RM255引物对(退火温度为48°C )上游引物5，-tgttgcgtgtggagatgtg-3’(序列表的序列 9)；下游引物5，-cgaaaccgctcagttcaac-3，(序列表的序列10)；RM134引物对(退火温度为58°C )上游引物5，-acaaggccgcgagaggattccg-3‘(序列表的序列11)；下游引物5，-gctctccggtggctccgattgg-3‘(序列表的序列1 ；RM223引物对(退火温度为50°C )上游引物5，-gagtgagcttgggctgaaac-3‘(序列表的序列1 ；下游引物5，-gaaggcaagtcttggcactg-3‘(序列表的序列14)；RM253引物对(退火温度为48°C )上游引物5，-tccttcaagagtgcaaaacc-3，(序列表的序列15)；下游引物:5，-gcattgtcatgtcgaagcc-3，(序列表的序列16)；RM258引物对(退火温度为48°C )上游引物:5，-tgctgtatgtagctcgcacc-3，(序列表的序列17)；下游引物5，-tggccttaaagctgtcgc-3，(序列表的序列18)。分别合成以上各条引物，以上各条引物组成引物组合物，各条引物单独包装。
实施例2、引物组合物的应用419份水稻材料均属于粳稻亚种，均获自于中国国家作物种质资源库，表2中所列统-编号为每份材料在中国国家作物种质资源库的统一编号(参见http://iCgr. caas.net. cn/)。张冬玲等Q009)利用SSR标记和中国稻种资源初级核心种质分析遗传结构和地理演化，将粳亚种分为水粳生态型、陆粳生态型和中间型生态型等三个生态型(aiang Dongling, Zhang Hongliang, Wang Meixing, Sun Junli, Qi Yongwen, Wang Fengmei, Wei Xinghua,Han Longzhi,Wang Xiangkun,Li Zichao. The Hierarchical Genetic Structure and Differentiation of Oryza sativa L. in China Revealed by MicrosatelIites. Theor Appl Genet 2009 116(6) :1105-1117)。依照文献的划分标准，419份水稻材料中， 水粳生态型品种177份、中间型生态型品种110份、陆粳生态型品种132份。应用实施例1制备的引物组合物分别鉴定419份水稻材料，步骤如下一、CTAB法提取水稻的基因组DNA(1)称取0. 4g-0. 5g的新鲜叶片，在研钵中加入液氮迅速研磨粉碎，然后转入 1. 5ml的无菌离心管中。(2)每管加入预热65°C的CTAB提取缓冲液(ρΗ8. 0) 700 μ 1 (配方见表1)，65°C水浴30分钟，每隔5分钟取出摇勻一次。(3)加入400 μ 1氯仿/异戊醇04 1)轻柔混摇10分钟，然后12000转/分钟离心10分钟。(4)取上清液转入另一 1.5ml的无菌离心管中，加入300 μ 1氯仿/异戊醇 (24 1)轻柔混摇10分钟，然后以12000转/分钟离心10分钟；(5)将上清液再次转入新的1. 5ml的无菌离心管中，加入等体积的预冷的(_20°C ) 异丙醇和1/10体积的预冷的(_20°C)乙酸钠(pH = 5. 2)，将离心管上下颠倒数次，置于-20°C冰箱30分钟以上。(6)将离心管以12000转/分钟离心10分钟，取沉淀。(7) 70%乙醇漂洗沉淀两次，无水乙醇漂洗一次，离心后，小心去掉乙醇。(8)晾干或风干后加入灭菌水溶解，使终浓度达到20ng/y 1，备用。表1提取缓冲液的配方(1000ml) pH = 8.0
权利要求
1.辅助鉴别水稻粳亚种生态型的引物组合物，由RM335引物对、RM5引物对、RM81a引物对、RM42引物对、RM255引物对、RMl34引物对、RM223引物对、RM253引物对和RM258引物对组成；所述RM335引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述冊5引物对为序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对； 所述RMSla引物对为序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对； 所述RM42引物对为序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成的引物对；所述RM255引物对为序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA组成的引物对；所述RM134引物对为序列表的序列11所示DNA和序列表的序列12所示DNA组成的引物对； 所述RM223引物对为序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA组成的引物对；所述RM253引物对为序列表的序列15所示DNA和序列表的序列16所示DNA组成的引物对；所述RM258引物对为序列表的序列17所示DNA和序列表的序列18所示DNA组成的引物对。
2.如权利要求1所述引物组合物，其特征在于所述水稻粳亚种生态型为水粳生态型、 中间型生态型或陆粳生态型。
3.权利要求1所述引物组合物在辅助鉴别水稻粳亚种生态型中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述水稻粳亚种生态型为水粳生态型、中间型生态型或陆粳生态型。
5.权利要求1所述的引物组合物在制备辅助鉴别水稻粳亚种生态型的试剂盒中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述水稻粳亚种生态型为水粳生态型、中间型生态型或陆粳生态型。
7.一种辅助鉴别水稻粳亚种生态型的试剂盒，含有权利要求1所述的引物组合物。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述水稻粳亚种生态型为水粳生态型、中间型生态型或陆粳生态型。
9.一种应用权利要求1所述引物组合物辅助鉴别水稻粳亚种生态型的方法，包括如下步骤(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，分别用所述RM335引物对、所述RM5引物对、所述RM81a引物对、所述RM42引物对、所述RM255引物对、所述RM134引物对、所述RM223引物对、所述RM253引物对和所述RM258引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(2)检测采用各个所述引物对得到的所述PCR扩增产物，按照如下标准进行赋值采用所述RM335引物对，如果得到IMbp的PCR扩增产物、RM335_115 = 1，如果没有得到 115bp 的 PCR 扩增产物、RM335_115 = 0 ；采用所述RM5引物对，如果得到114bp的PCR扩增产物、RM5_114 = 1，如果没有得到 114bp 的 PCR 扩增产物、RM5_114 = 0 ；采用所述RM81a引物对，如果得到116bp的PCR扩增产物、RM81a_116 = 1，如果没有得到 116bp 的 PCR 扩增产物、RM81a_116 = 0 ；采用所述RM42引物对，如果得到165bp的PCR扩增产物、RM42_165 = 1，如果没有得到 165bp 的 PCR 扩增产物、RM42_165 = 0 ；采用所述RM255引物对，如果得到150bp的PCR扩增产物、RM255_150 = 1，如果没有得到 150bp 的 PCR 扩增产物、RM255_150 = 0 ；采用所述RMlM引物对，如果得到85bp的PCR扩增产物、RM134_85 = 1，如果没有得到 85bp 的 PCR 扩增产物、RM134_85 = 0 ；采用所述RM223引物对，如果得到的PCR扩增产物、RM223_155 = 1，如果没有得到 155bp 的 PCR 扩增产物、RM223_155 = 0 ；采用所述RM253引物对，如果得到140bp的PCR扩增产物、RM253_140 = 1，如果没有得到 140bp 的 PCR 扩增产物、RM253_140 = 0 ；采用所述RM258引物对，如果得到127bp或130bp的PCR扩增产物、RM258_127/130 = 1，如果没有得到127bp且没有得到130bp的PCR扩增产物、RM258_127/130 = 0 ； (3)将步骤( 得到的各个赋值代入如下判别式a = (0. 93*RM335_115+0. 87*RM5_114+0. 84*RM81a_116)/(0· 93+0. 87+0. 84)； b = (0. 99*RM223_155+0. 82*RM253_140+0. 99*RM258_127/130)/(0. 99+0. 82+0. 99)； c = (0. 84*RM42_165+0. 89*RM255_150+0. 85*RM134_85)/(0. 84+0. 89+0. 85)； 如果a > b且a > c，所述待测水稻为候选的水粳生态型； 如果b > a且b > c，所述待测水稻为候选的中间型生态型； 如果c > a且c > b，所述待测水稻为候选的陆粳生态型； 所述水稻粳亚种生态型为水粳生态型、中间型生态型或陆粳生态型。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于采用所述RM335引物对进行所述PCR扩增的退火温度为52°C ；采用所述RM5引物对进行所述PCR扩增的退火温度为48°C ；采用所述 RMSla引物对进行所述PCR扩增的退火温度为50°C;采用所述RM42引物对进行所述PCR扩增的退火温度为50°C ；采用所述RM255引物对进行所述PCR扩增的退火温度为48°C ；采用所述RM134引物对进行所述PCR扩增的退火温度为58°C ；采用所述RM223引物对进行所述 PCR扩增的退火温度为50°C;采用所述RM253引物对进行所述PCR扩增的退火温度为48°C; 采用所述RM258引物对进行所述PCR扩增的退火温度为48°C。
全文摘要
本发明公开了一种用于鉴别水稻粳亚种生态型的引物组合物及其应用。本发明的引物组合物由如下引物对组成序列1和2所示DNA组成的RM335引物对、序列3和4所示DNA组成的RM5引物对、序列5和6所示DNA组成的RM81a引物对、序列7和8所示DNA组成的RM42引物对、序列9和10所示DNA组成的RM255引物对、序列11和12所示DNA组成的RM134引物对、序列13和14所示DNA组成的RM223引物对、序列15和16所示DNA组成的RM253引物对、序列17和18所示DNA组成的RM258引物对。本发明的引物组合物可用于水稻粳亚种生态型鉴定，具有快捷高效、灵敏度高、分辨力好、结果准确可靠等优点，适用于水稻品种鉴定、水稻育种及植物进化研究等。
文档编号C12N15/11GK102296122SQ20111027183
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者宋立莹, 张冬玲, 张洪亮, 李自超, 王凤梅, 王美兴, 马占峰 申请人:中国农业大学