校准方法、设备和计算机程序产品的制作方法
【专利说明】校准方法、设备和计算机程序产品
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 此申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请No. 61/792,409的权益，在此 通过援引将该申请的内容完整收入本文。 发明领域
[0003] 本公开文本设及生物技术领域。更具体地说，本公开文本设及使用来自实时扩增 规程的结果量化多核巧酸的校准方法和系统。
[0004] 发明背景
[0005] 现在常规使用牵设体外核酸扩增的动力学分析的方法来量化分析物核酸。在有时 称作"实时"扩增规程的运些规程中，在扩增规程的过程上作为时间的函数监测核酸扩增反 应混合物中存在的扩增子的量。完全自动化的实时核酸测定法需要能够分析在反应期间获 取的时间依赖性数据的机器可执行算法。在运点上，需要精确输出核酸的量或浓度（它会 产生观察扩增结果）的数据处理算法。
[0006] 专利文献中已意识到与量化特定核酸祀的绝对量有关的困难。运些困难已归于 扩增过程的指数性质及任何控制反应速率的变量（包括引物对的长度和核巧酸序列）的 小差异能引起扩增子产量的剧烈差异的事实。Wang等人在美国专利No. 5, 219, 727中描 述了使用扩增分析物多核巧酸的相同引物扩增的内部标准品的使用，而且解决了与量化的 特定祀核酸无关的第二套寡核巧酸引物是使用无关cDNA作为标准品所必需的事实。依 照Wang等人，使用两套无关引物的分析只能提供两个独立扩增反应的相对比较，而非祀核 酸浓度的绝对测量。其他人跟随运种技术，并采用通过具有相似序列且通过用共用引物 对进行扩增而类似感兴趣祀的内部标准品（参见已公布的流水号10/230,489的美国专 利申请）。还有其他人描述了依赖于测定扩增效率的定量方法（参见已公布的欧洲专利 申请EP1138784)。牵设测定对照和祀序列的扩增比的方法也已有记载（参见美国专利 No. 6, 066, 458)。
[0007] 用于对实时核酸扩增结果实施内部校准调节的最常用方法包括"运行内"校准调 节和调节"存储"校准曲线。运些方法中的第一种（由McMillan等人在US6, 713, 297中 例示）在每次绘制校准曲线图时需要两种或更多种校准标准品与重复的分析物核酸平行 进行常规扩增。不幸的是，运种要求在每次再校准仪器时消耗一般W试剂盒形式购买且可 能是昂贵的有限试剂。第二方法（由Carrick在US7, 930, 106中例示）有利地避免在每 次再校准仪器时对运行多种校准物的需要，但是仍然需要（例如由试剂盒制造商或终端用 户进行）在一些点绘制完全校准曲线图。运种技术的经验显示较好的能力，当所量化的祀 W高或很高水平存在时使用一种校准标准品再生成定量结果。例如，回溯检验确认了使用 一种具有1〇7个祀拷贝的调节校准物调节存储的曲线有利地再生成在10 4至10S个祀拷贝 的范围中几乎相同的完全本地曲线。在运种情况中，经过调节的曲线在输入量1〇2个祀拷 贝处偏离本地曲线不超过〇.61og个拷贝。相反，使用一种具有1〇2个祀拷贝的调节校准物 产生在输入祀水平1〇3个祀拷贝处偏离0. 41og个拷贝且在输入祀水平106个祀拷贝处偏离 i.eiog个拷贝的经过调节的曲线。因此，使用具有高祀量的校准标准品调节存储的曲线显 然有好处。
[0008]甚至鉴于运些有用办法，仍然需要允许使用体外扩增技术高度精确量化核酸的自 动化解决方案，其中可简化方式执行内部校准调节。此外，会想要能够使用一种包含低 浓度的分析物多核巧酸标准品的校准标准品在要测量的祀量或浓度的完全动态范围间实 现精确量化。本公开文本解决运些问题。
[0009] 发明概述
[0010] 本公开文本的第一个方面关于为使用扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的 本地仪器实施的定量测定法建立经过调节的校准曲线的方法。该方法包括步骤（a)，为对定 量测定法特异性的校准曲线上的一个固定点获得一对坐标，其中该对坐标规定分析物多核 巧酸的量和标准化扩增指标值。还有步骤化），获得包含固定量的内部校准物和已知量的分 析物多核巧酸的调节校准物。还有步骤（C)，使用本地仪器共扩增调节校准物的分析物多核 巧酸和内部校准物。还有步骤（d)，为步骤（C)中共扩增的分析物多核巧酸和内部校准物每 一项确定扩增指标。还有步骤（e)，将为分析物多核巧酸确定的扩增指标针对为内部校准 物确定的扩增指标标准化。还有步骤（f)，通过绘制包含第一点和第二点的校准曲线图建 立经过调节的校准曲线，其中第一点包含调节校准物的分析物多核巧酸的已知量和标准化 步骤（d)中为分析物多核巧酸确定的扩增指标的坐标，且其中第二点包含步骤（a)中为固 定点获得的对坐标。在一个优选实施方案中，由步骤（a)中获得的对坐标规定的分析物多 核巧酸的量是使用除本地仪器W外的第一实时扩增和监测仪器确定的，且不是使用来自用 本地仪器实施的任何扩增反应的结果确定的。更优选的是，该方法进一步包括用第一实时 仪器共扩增多种校准标准品每一种中含有的分析物多核巧酸和内部校准物的步骤，其中多 种校准标准品每一种包含不同起始浓度的调节校准物的分析物多核巧酸，且其中多种校准 标准品每一种中和调节校准物中的内部校准物的浓度是基本上相同的。或者，步骤（a)的 校准曲线和步骤（f)中建立的经过调节的校准曲线可W均为通过线性方程式描述的线性 校准曲线。依照一个不同优选实施方案，步骤（a)和步骤化）共同牵设获得（例如购买） 包括调节校准物和固定点的对坐标的有形体现的试剂盒。在运种情况中，有形体现可包括 机器可读条形码。依照还有另一个优选实施方案，在步骤（a)之前有通过拟合方程式至使 用除本地仪器W外的扩增核酸并随扩增发生监测扩增子合成的多台仪器获得的结果集合 绘制对定量测定法特异性的校准曲线的步骤，其中结果集合不包含使用本地仪器获得的结 果。依照还有另一个优选实施方案，步骤（f)牵设通过用与本地仪器通讯的处理器绘制包 含第一点和第二点的校准曲线图建立经过调节的校准曲线。例如，与本地仪器通讯的处理 器可W是本地仪器的整合构件。依照还有另一个优选实施方案，步骤（a)中获得的对坐标 规定当校准曲线的标准化扩增指标值为零时分析物多核巧酸的量。依照其中由步骤（a)中 获得的对坐标规定的分析物多核巧酸的量是使用除本地仪器W外的第一实时扩增和监测 仪器确定的且不是使用来自用本地仪器实施的任何扩增反应的结果确定的某些实施方案， 步骤（a)中获得的对坐标规定当校准曲线的标准化扩增指标值为零时分析物多核巧酸的 量。依照其中在步骤（a)之前有通过拟合方程式至使用除本地仪器W外的扩增核酸并随扩 增发生监测扩增子合成的多台仪器获得的结果集合绘制对定量测定法特异性的校准曲线 的步骤且其中结果集合不包含使用本地仪器获得的结果的不同优选实施方案，步骤（a)中 获得的对坐标规定当校准曲线的标准化扩增指标值为零时分析物多核巧酸的量。
[0011] 本公开文本的另一个方面关于使用核酸扩增测定法量化测试样品中可能存在的 分析物多核巧酸的计算机程序产品，该核酸扩增测定法牵设用扩增核酸并作为时间的函数 监测扩增子合成的本地仪器共扩增分析物多核巧酸和固定量的内部校准物。该计算机程序 产品包括用于实施一系列步骤的软件指令的有形体现。运些步骤包括步骤（a)，为对要用于 量化分析物多核巧酸的核酸扩增测定法特异性的校准曲线上的一个固定点接收一对坐标， 其中该对坐标规定分析物多核巧酸的量和标准化扩增指标值。还有步骤化），为已知量的 分析物多核巧酸的扩增指标获得针对调节校准物中含有的且在用本地仪器实施的第一扩 增反应中共扩增的固定量的内部校准物的扩增指标标准化的值。还有步骤（C)，绘制包含 第一点和第二点的经过调节的校准曲线，其中第一点包含调节校准物的分析物多核巧酸的 已知量和步骤化）中获得的值的坐标，且其中第二点包含步骤（a)中为固定点接收的对坐 标。还有步骤（d)，为测试样品中的未知量的分析物多核巧酸的扩增指标获得针对在用本地 仪器实施的第二扩增反应中与之共扩增的固定量的内部校准物的扩增指标标准化的值。还 有步骤（e)，将步骤（d)中获得的值与经过调节的校准曲线比较从而为测试样品中存在的 未知量的分析物多核巧酸产生定量结果。还有步骤（f)，输出来自步骤（e)的定量结果的 有形记录。在一个优选实施方案中，步骤（a)中接收的对坐标规定当校准曲线投射至标准 化扩增指标值零时分析物多核巧酸的量。在一个不同实施方案中，软件指令的有形体现包 括在可W是下述各项的介质上存储的软件指令：光盘，磁存储介质，闪存驱动器，计算机硬 盘驱动器，和由至少一台计算机可存取的网络驱动器。在一个不同实施方案中，步骤化）和 步骤（d)各自牵设通过数学计算来获得。在一个不同实施方案中，步骤化）和（d)牵设通 过接收相应值的数字输入来获得。在一个不同实施方案中，步骤（C)中绘制的经过调节的 校准曲线通过线性方程式定义。在一个不同实施方案中，步骤（e)的有形记录印刷在纸上。 在一个不同实施方案中，核酸扩增测定法为等溫核酸扩增测定法。
[0012] 本公开文本的另一个方面设及用于测定测试样品中祀核酸序列的起始数量的设 备。该设备包括（a)至少一台测量下述各项的检测机械：（i)指示在第一核酸扩增反应中 扩增的祀核酸序列和第一内部校准物的相应数量的信号，其中第一内部校准物包含与祀核 酸序列不同的第二核酸序列；（ii)指示在第二核酸扩增反应中扩增的已知量的分析物多 核巧酸和第二内部校准物的相应数量的信号，其中分析物多核巧酸和第二内部校准物均是 调节校准物的成分，其中第二内部校准物包含第二核酸序列，且其中第一和第二核酸扩增 反应中第二核酸序列的起始数量基本上相等。所发明的设备进一步包括化）至少一台与检 测机械通讯的处理器，其中处理器编程有一个固定点的一对坐标，该对坐标规定分析物多 核巧酸量和标准化扩增指标值，且其中处理器进一步编程为实施下述步骤：（i)自测量的 信号为已知量的分析物多核巧酸、第一和第二内部校准物每一种、和祀核酸序列的扩增指 标确定相应值；（ii)将为祀核酸序列确定的扩增指标值针对为第一内部校准物确定的扩 增指标值标准化；（iii)将为已知量的分析物多核巧酸确定的扩增指标值针对为第二内部 校准物确定的扩增指标值标准化；（iv)自固定点、分析物多核巧酸的已知量和已知量的分 析物多核巧酸的标准化扩增指标建立校准曲线；并（V)使用校准曲线和祀核酸序列的标准 化