位点有利于ssDNA变体进行修复，则分辨的载体不被能够切割这些位点的 限制性酶降解。相比之下，如果限制性位点中的一个或多个有利于ssDNA中间体修复，则所 得到的载体对通过能够切割那些位点的限制性酶的切割敏感。
[0093] 在一个实例中，ssDNA中间体包括特定限制性位点的单个拷贝，并且限制性位点位 于ssDNA变体能够与之杂交的区域内。ssDNA变体不包括任何取向的限制性位点。相应地， 限制性位点包括一个或多个错配核苷酸，其可以例如在体内进行修复。如果限制性位点错 配有利于ssDNA变体进行修复，则所得到的载体对通过特定限制性酶的降解敏感。可替代 地，如果限制性位点错配有利于ssDNA中间体进行修复，则所得到的载体将包括限制性位 点，且对通过特定酶的降解敏感。在具体实例中，ssDNA中间体是尿嘧啶化的。
[0094] 在多个实施方案中，ssDNA变体不包括限制性位点，因为限制性位点不存在于 ssDNA变体基于其生成的模板分子中。在其他实施方案中，ssDNA变体不包括限制性位点， 因为限制性位点被诱变事件破坏。如上所述，本发明的多个实施方案可以包括衍生自两种 或更多种不同目的序列，并且能够与ssDNA中间体杂交的ssDNA变体。在此类情况下，两种 或更多种ssDNA变体各自能够与之杂交的ssDNA中间体的区段可以各自包括限制性位点。 在一些情况下，ssDNA变体能够与之杂交的两个或更多个区段各自包括相同的特定限制性 位点。在其他实施方案中，ssDNA变体能够与之杂交的两个或更多个区段包括两个或更多 个不同的限制性位点。
[0095] 在某些情况下，一种或多种ssDNA变体能够与之杂交的ssDNA中间体的一个或多 个区段可以各自包括单个限制性位点。在其他实施方案中，一种或多种ssDNA变体能够与 之杂交的ssDNA中间体的区段可以包括两个或更多个限制性位点。
[0096] 在一些实施方案中，一种或多种分辨的载体是分离的和/或纯化的且用一种或多 种限制性酶在体外进行处理，以降解有利于分辨ssDNA中间体链或未充分掺入ssDNA变体 的载体。
[0097] 在一些实施方案中，有利于分辨ssDNA中间体链或未充分掺入ssDNA变体的一种 或多种载体在体内被降解。特别地，分辨的载体可以存在于表达限制性酶的细胞中，且包括 限制性酶能够降解的一个或多个限制性位点。在再更特定的实施方案中，分辨的载体可以 存在于表达限制性酶Ec〇29kI的细胞中。细胞可以是例如细菌细胞，例如大肠杆菌细胞，例 如TG1细胞。
[0098] 在特定实施方案中，非重组载体的体内降解可以用于促进以免疫球蛋白形式的重 和轻链可变区以及IgG恒定区的ssDNA变体的重组。轻链可变结构域和重链可变结构域可 以是例如scFv轻链可变结构域和重链可变结构域。在一些实施方案中，编码至少IgG重链 恒定结构域的核酸包括包含限制性位点的区段，并且编码至少IgG轻链恒定结构域的核酸 包括包含限制性位点的区段。重链和轻链核酸可以存在于分开的载体上、单一载体上，或在 双顺反子表达系统中排列（参见例如图5-7)。在特定实施方案中，轻链可变结构域和重链 可变结构域分别与编码IgG轻链恒定结构域的核酸和编码IgG重链恒定结构域的核酸杂 交，使得杂交载体的分辨去除或修饰各自的限制性位点。这导致形成编码IgG重链的核酸 和编码IgG轻链的核酸，各自可能掺入一种或多种ssDNA变体。如上所述，这两种构建体可 以存在于分开载体（例如用于在单一细胞内表达）或单一载体（例如用于分开的表达或在 双顺反子排列中）上。构建体可以转移到例如细菌内且可以在其中分辨。
[0099] 在特定实施方案中，限制性位点是SacII限制性位点。在特定实施方案中，体内降 解是通过Eco29kI且细菌是表达Eco29kI的细菌。
[0100] 通过本文描述的方法描述、生成或能够生成的载体可以适合于转移至非细菌细胞 类型例如CH0细胞。载体可以包括足以指导载体中存在的一种或多种蛋白在一个或多个细 胞类型中表达的序列信息。作为非限制性实例，通过本发明的方法生成的载体可以包括能 够在CH0细胞中表达的IgG重链和IgG轻链（图8)。
[0101] 用于降解有利于分辨ssDNA中间体链或未充分掺入ssDNA变体的载体的上述方 法和组合物可以使在多个靶向基因座各自处的重组核酸、充分重组的核酸、或核酸重组体 的回收改善 10% 或更多，例如 10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、500% 或 1000%或更多。
[0102] 目的序列的变体文库的大小和特征 本发明的方法可以获得变体总数目大于约1E+05,例如约1E+05、1E+06、1E+07、1E+08、 1E+09、1E+10、1E+11或1E+12种变体或更多的变体文库。在通过本发明的方法产生的转化 体中，重组转化体的数目可以大于30%，例如约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在 重组体中的突变率可以是至少约0. 75%，例如约0. 75%、0. 8%、0. 85%、0. 9%、0. 95%、1%、1. 5%、 2%、2. 5%或3%。文库大小、重组体百分比和重组体中的突变率取决于异源双链DNA分子的 数目、尝试的转化次数、转化方法、扩增目的序列的方法及其他因素。
[0103] 测定诱变效率 本发明的方法可以用于产生目的序列的变体文库。在本文描述的方法的一些实施方案 中，测定诱变效率是有利的。用于测定诱变效率的机制可以是定量的、半定量的或定性的。
[0104] 在测定诱变效率的一种机制中，蓝色/白色报道分子筛选与本发明的方法结合使 用。用于蓝色/白色报道分子筛选中的一些已知构建体包括LacZ基因。在此类实施方案 中，LacZ的表达可以是组成性的、例如可通过IPTG诱导的、或通过多种手段包括例如阻遏 调节的。LacZ基因可以存在于细胞的基因组中、质粒上、本发明的异源双链DNA分子中、或 本发明的分辨载体中。LacZ基因的表达产生β-半乳糖苷酶，能够以导致蓝色色素的方式 切割X-gal的酶。包括足够量的β-半乳糖苷酶和X-gal的细胞将是蓝色的。诱变可以破 坏通过β-半乳糖苷酶的X-gal切割。当这发生时，细胞将看起来是白色的。此外，白色菌 落百分比指示诱变效率。高百分比的白色菌落指示足以破坏LacZ表达和/或通过β -半乳 糖苷酶的X-gal切割的突变经常发生，而低百分比的白色菌落指示此类突变经常不发生。
[0105] 在某些实施方案中，白色菌落的百分比可以在实验上或理论上与特定频率的诱变 关联，由此白色菌落的百分比提供诱变效率的估计量。
[0106] 在某些实施方案中，在其中应用蓝色/白色筛选的细胞是实验细胞，例如包括已 诱变的序列的细胞，以便鉴定具有特定特征的变体。在其他实施方案中，细胞是与实验细胞 平行诱变的对照细胞。
[0107] 在本发明的多个其他实施方案中，筛选鉴定除蓝色色素沉着外的表型。在此类情 况下，标记物构建体无需是包括lacZ基因的构建体，而是包括能够体现可检测表型的一些 其他标记物基因的构建体。例如，能够被诱变破坏的可检测表型可以是、但不限于发光、荧 光、抗生素抗性、抗生素敏感性、毒素抗性、毒素敏感性、改变的生长速率、改变的对分析物 的响应、改变的细胞结构、改变的集落形成、或改变的营养缺陷型。另外的可检测表型是本 领域已知的。此外，能够体现这些可检测表型的基因也是本领域已知的。例如，可检测表型 可以起因于下述的表达：绿色荧光蛋白（例如gfp)、红色荧光蛋白（例如rfp)、黄色荧光 蛋白（例如yfp)、氨苄青霉素抗性基因（amp)、四环素抗性基因（tet)、卡那霉素抗性基因 (kan)、β-半乳糖苷酶（β-gal)、丙氨酸合成基因（例如argA)、半胱氨酸合成基因（例如 cysE)、亮氨酸合成基因（例如lysA)、苏氨酸合成基因（例如thrC)、或本领域已知的多种 其他天然或合成基因中的任一种。可替代地，标记物蛋白可以是功能盒，其例如通过转录因 子的表达，指导或促成体现可检测表型的基因的表达。在此类情况下，体现可检测表型的基 因可以是对于细胞内源的或由载体编码的。在其中细胞子集预期不能在测定条件下发展的 实施方案中，关于许可条件的复制平板或另一种相似效应的技术可以用于测定具有所示表 型的细胞百分比。进一步地，用于选择或分离具有可检测表型的细胞的方法是本领域已知 的。取决于可检测表型，选择或分离具有起因于标记物蛋白表达的表型的一种或多种细胞 可以包括流式细胞术、在有关抗生素或毒素的存在下培养细胞群体、在特定有机化合物的 存在或不存在下培养细胞群体、或显微镜技术。选择且分离具有特定可检测表型的细胞的 另外方法是本领域已知的。
[0108] 定向进化 本发明的变体文库可以用于噬菌体展示或定向进化的方法中。本发明的ssDNA中间体 可以是适用于噬菌体展示的噬菌粒，其实例是本领域已知的。目的序列的变体文库的细胞 与辅助噬菌体一起孵育，可以导致由目的序列的变体编码的蛋白的展示。展示蛋白变体的 细胞可以与一种或多种靶分子共孵育，所述一种或多种靶分子例如蛋白变体可以与之相互 作用的一种或多种蛋白、分子或化合物。靶分子可以是小分子、蛋白或其结构域、人蛋白或 其结构域，酶，病原体蛋白或其结构域，抗体或其结构域，或重组蛋白。蛋白变体可以结合、 切割或修饰靶分子。可替代地或另外地，目的序列的蛋白变体可以诱导靶分子中的构象变 化，或催化靶分子的反应。通过定向进化鉴定的序列可以用作后续多样化和选择循环中的 目的序列。
[0109] 实施例1:尿嘧啶化的环状ssDNA的产生 在本发明中，尿嘧啶化的环状ssDNA可以充当DNA模板分子、尿嘧啶化的环状ssDNA中 间体或两者。尿嘧啶化的环状ssDNA可以是噬菌体或噬菌粒ssDNA分子。一种产生尿嘧啶 化的环状ssDNA的方法利用CJ236大肠杆菌细胞（基因型：FA Pil+ CamR)/ -76770/7 England Biolabs)。该菌株的细胞缺 乏功能dUTPase和尿嘧啶-N糖基化酶。首先，将电感受态的CJ236细胞的等分试样（25μL) 吸取到冷却的0.1mm间隙比色杯内，并且将1μLΡΑΡΙΙΙ6质粒DNA加入CJ236细胞中。细 胞在BioRad电穿孔仪中以1.6伏特进行电穿孔。紧在电穿孔后，加入1mlS0C培养基，并 且将培养基加上细胞转移至14 ml Falcon品牌培养管。培养物在37°C下伴随振荡（~225 rpm)孵育1小时。在该一小时结束时，将250μL经转化的细胞直接涂布到LB +CAM +AMP 平板上。这些平板在37°C下孵育过夜。
[0110] 为了产生噬菌体，将1ml含有LB和氨苄青霉素（60Pg/ml)的生长培养基和100 μLM13K07辅助噬菌体（NEB，10nPFU/ml)加入培养管中。随后使用单个10μL吸管端，用 来自过夜转化平板的30个菌落接种培养基。将培养物以200rpm在37°C下振荡两小时，这 之后加入0. 5μL卡那霉素原液（最终浓度30Pg/ml)，并且将培养物以225rpm在37°C下 振荡6小时或直至混浊。将培养物稀释到在250ml玻璃带挡板烧瓶中的30ml新鲜2YT 培养基内，所述新鲜2YT培养基含有氨苄青霉素（60Pg/ml)、卡那霉素（30Pg/ml)和尿苷 (0. 3Pg/ml)。将培养物以225rpm在30°C下振荡过夜（大约18小时）。
[0111] 在振荡过夜后，将30ml培养物转移至圆底离心管，并且细胞通过在Sorvall RC-5B离心机中在4°C下以15, 000rpm离心15分钟沉淀，所述SorvallRC-5B离心机使 用SS34转子或等价转子。上清液使用0.22Mm管顶滤器进行过滤，并且将滤液转移至含 有6ml20%PEG8000/2. 5MNaCl的新的圆底管。每个管用石蜡膜覆盖，且倒转几次以混 合，并且随后在冰上孵育60分钟。每个管在4°C下以10Krpm在使用SS34转子的Sorvall RC-5B离心机中离心20分钟。将上清液倾析，并且将管再次以5Krpm在使用SS34转子的 SorvallRC-5B离心机中离心5分钟。使用吸管抽吸剩余液体，留下噬菌体沉淀。将噬菌体 沉淀重悬浮于500μLIX无菌PBS中，并且转移至1. 7ml管。将重悬浮的菌体在4°C下 在台式微量离心机中以4°C以最高速度（14Krpm)离心5分钟。
[0112] 离心的重悬浮的噬菌体的上清液转移至新的1. 5ml管。接下来，将7μL缓冲液 MP(QiagenΜ13试剂盒）加入噬菌体制剂且混合，随后在室温下孵育5分钟。将样品施加于 QIAprep旋转柱（QiagenM13试剂盒）。将柱以8Krpm在台式微量离心机中离心30秒，并 且弃去流通物。随后将700μL缓冲液MLB加入柱（QiagenM13试剂盒）中，并且将柱以8K rpm在台式微量离心机中离心15秒。将700μL另外的缓冲液MLB加入柱中，并且使柱在 室温下孵育至少1分钟，随后以8Κrpm在台式微量离心机中离心30秒。接下来，加入700 μL缓冲液PE(QiagenM13试剂盒），并且将柱以8Krpm在台式微量离心机中离心15秒。 重复该步骤。将柱转移至新鲜的1. 7ml管。将100μι缓冲液EB(M13试剂盒）加入柱膜 中，并且使柱在室温下孵育10分钟，并且随后以8Krpm在台式离心机中离心30秒。含有 dU-ssDNA的洗脱物通过在1%琼脂糖TAE凝胶上运行1. 0μL洗脱物进行分析。DNA作为占 优势的单一条带出现，但通常可见较低电泳迀移率的模糊条带，可能由dU-ssDNA中的二级 结构引起。
[0113] 实施例2:易错PCR 在本发明中，易错PCR可以用于生成目的序列的变体。在本实施例中，一种PCR引物 通过引入硫代磷酸酯在其5'末端处进行修饰。目的序列使用寡核苷酸和第二寡核苷酸进 行扩增，所述寡核苷酸具有三个或更多个5'硫代磷酸酯，并且能够与目的序列的一条链杂 交，所述第二寡核苷酸具有少于三个硫代磷酸酯，能够与目的序列的相反链杂交。为了进行 易错PCR，使 10μL10X诱变PCR缓冲液[70mMMgCl2、500mMKC1、100mMTris(pH8.3)、 0·l%(wt/vol)明胶]与 10μL10XdNTP混合物（2mMdGTP、2mMdATP、10mMdCTP、10 mMdTTP)、各30pmoles设计为扩增目的DNA的正向引物和反向引物组合。对于scFv基 因，我们使用：（AXL6AS4-PCRR5'PhosG*T*C*G*ACTGAGGAGACGGTGACC);和（AXL6KunkPCRF2 AAGCTTTCCTATGAGCTGACACAGCC)，其中星号限定通过硫代磷酸酯连接的碱基对。反应利用1、 10或20fmoles输入DNA(即每种量的分开反应），其中水加入至88KL的总体积。随后加 入10μL5mM1111(：12并且充分混合；验证任何沉淀物的不存在。加入2PLDNA聚合 酶，以使最终体积达到100KL。反应在BioradT100热循环仪上循环30个循环（94°C1分 钟、55°C1分钟、72°C1分钟）。在PCR完成后，根据制造商的方案，使用QiagenQIAquick PCR纯化试剂盒进行反应提纯（cleanup)。产物大小为大约800个碱基对。
[0114] 实施例3:T7处理 为了消化具有少于三个硫代磷酸酯的链，使用Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒纯化 的40 41?〇?产物与10卜1了7核酸外切酶（10,000单位/1111)一起，在1\呢8缓冲液中 在25°C下在BioRad T100热循环仪中孵育1小时。T7处理的产物使用Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，并且在40μLEB缓冲液/反应中进行洗脱。
[0115] 这些硫代磷酸酯提供了保护初始双链PCR产物免于5'至3'核酸外切酶T7的水 解作用，而相对的未受保护的链被水解。我们发现一个或两个硫代磷酸酯不足以阻止水解， 但3或4个硫代磷酸酯的添加导致相应链的完全保护。
[0116] 硫代磷酸酯可以通过保护任何不完全连接的异源双链体产物免于通过大肠杆菌 中的细胞溶质核酸外切酶的降解，在体内提供另外利益，阻止突变的偏差掺入。
[0117] 双链PCR产物转换为单链DNA变体。
[0118] 在有利于核苷酸错误掺入的条件下，来自800碱基对scFv基因扩增的PCR产物用 或不用T7或λ核酸外切酶在25°C下处理1小时。在处理后，产物在用SYBR-Gold染色的 非变性丙烯酰胺凝胶上显现。ssDNA产物显示比相应的dsDNA更慢的迀移率（图2)。如预 期，如果引物无一含有硫代磷酸酯，则T7核酸