短端粒丰度的量度的制作方法
【专利说明】短端粒丰度的量度
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求在2013年5月22日提交的美国临时申请号61/826, 484的权益，该申 请以引用方式整体并入本文中。
[0003] 发明背景
[0004] 背景中的陈述不一定意味着认可所引用的参考文献中的特征描述。
[0005] 端粒是真核生物染色体的尖端，其保护染色体免于溶核退化、端与端融合和重 组。端粒是染色体末端的结构，其特征为核苷酸序列（5'-TTAGGG-3'）n的重复。端粒由于 正常细胞分裂而缩短并且极短的端粒导致细胞衰老或凋亡。过去十年在人类中的丰富的 流行病学和临床研究已经将短端粒长度与老龄化相关疾病和全因死亡的高风险联系起来 (Puterman，E.和E.Epel，SocPersonalPsycholCompass，2012.6(ll)807_825;Zhu，H·、 M.Belcher和P.vanderHarst，ClinSci(Lond)，2011. 120 (10) 427-40;和Fyhrquist，F. 和0.Saijonmaa.AnnMed, 2012. 44增刊1S138-42)。遗传、环境、生活方式和行为因素共同 影响端粒长度。因此，端粒长度已成为总体健康、疾病和死亡风险的指标。
[0006] 虽然平均端粒长度在几乎所有公开的临床研究中被测量并且已经在患者疾病 和死亡风险的分层中显示效用，但最近在小鼠中的工作也已显示短端粒群体是衰老或凋 亡的触发信号（Hemann，M.T.等，Cell, 2001，107 (1)67-77)，且因此是疾病和死亡风险的 触发信号。在由Hemann等报道的研究中，将具有短端粒的第6代端粒酶RNA敲除小鼠 (mTR-/-G6)与具有长端粒的端粒酶杂合型小鼠（mTR+/_)进行杂交。尽管端粒酶缺失后 代的端粒中的一半是长的，但是其表型反映mTR-/-母本的表型，这表明短端粒的数量而 非平均端粒长度对于细胞活力和染色体稳定性是关键的。在服用由天然产品衍生的端粒 酶激活剂:(TA-63?)的人中，在白细胞中检测到显著降低的短（〈3或<4kbp)端粒的百分 比（如通过定量FISH技术所测量；参见（Canela，A.等，ProcNatlAcadSciUSA，2007， 104 (13) 5300-5)，然而没有观察到平均端粒长度的变化（Harley,C.B.等，Rejuvenation Res. 2011，14(1)45-56)。因此短端粒丰度的百分比的变化被预期为生活方式和药理干预 或其它干预对端粒的影响的更灵敏量度。另一项研究（Vera等，"TheRateofIncrease ofShortTelomeresPredictsLongevityinMammals'，，CellReports(2012)，万维网 URL:dx.doLorg/10. 1016/]·celr印· 2012. 08. 023)发现"短端粒丰度的增加速率是寿命的 预测指标"。
[0007] 已经开发了用于测量基因组DNA中的端粒长度的多种方法，包括DNA印 迹（Kimura，M.等，NatureProtocols, 2010, 5: 1596-1607)、Q-FISH(Rufer，N. 等，Nat.Biotechnol·，1998，16:743-747)、流式FISH(Baerlocher，G· M.等，Cytometry, 2002, 47:89-99)和qPCR(Cawthon，R.M·，Nucleic.Acids Res.，2002, 30(10) :e47)。所有这些方法均可以在临床环境中被用来监测健康状况并允许 医师根据个体患者的需求规定预防性或治疗性干预。
[0008] 为了测量短端粒的群体，中期扩散细胞的定量荧光原位杂交（Q-FISH)已 经被用来生成表示个别端粒的长度的端粒信号强度的直方图（P〇〇n，S.S.等， Cytometry，1999. 36 (4) 267-78)。这种方法的限制为需要活细胞，成本高，且通量低。Q-FISH测定的高通量改良型（HTQ-FISH;参见Canela，A.等，ProcNatlAcadSciUSA，2007， 104(13)5300-5)最近被LifeLength公司（西班牙）支持用于测量短端粒的百分比。尽 管这样声称，然而可惜的是，利用当前技术，这种测定无法准确，原因是端粒尤其短端粒在 单一斑点中的聚族（端粒联合；参见Paeschke,K.、K.R.McDonald和V.A.Zakian.FEBS Lett, 2010. 584 (17) 3760-72)。困扰这个问题的事实是短端粒相比长端粒倾向于更频繁地 彼此联合。另外，已知FISH技术遭受探针与活细胞或固定细胞中的大分子的非特异性结 合。低成本且不需要活细胞的用于测量短端粒百分比的高通量方法将更容易适应流行病学 和临床环境，并且相比Q-FISH将具有更好的分析性能。
[0009] 美国专利第5, 741，677号（Kozlowski等）涉及用于测量端粒长度的方法。一种 方法涉及使端粒与接头序列接触，这是在该接头序列与端粒的3'末端连接或以另外方式 共价结合的条件下进行。端粒序列是通过长PCR扩增，其中第一引物对接头序列具有特异 性并且第二引物对染色体的亚端粒区域具有特异性。另一种方法涉及制备细胞的DNA提取 物，使所述提取物与和端粒重复序列互补的寡核苷酸探针孵育，以及测定结合的探针的量 作为端粒长度的量度。另外，描述了一种通过使基因组DNA与固相结合并使结合的DNA与 标记探针杂交来测量端粒长度的方法。
[0010] 美国专利公开第2004/0265815号（Baird等）涉及一种用于测量端粒长度的 方法。Baird等描述了以下步骤来检测端粒群体的长度：a)使单链寡核苷酸（下文称作 telorette)的3'末端与包含富G端粒链（包含TTAGGG重复序列）的端粒的单链突出 退火并使telorette共价结合至富C端粒链（具有CCCTAA重复序列）的5'末端；b)扩 增在步骤（a)中所形成的连接产物以形成引物延伸产物；和（c)检测步骤（b)的引物延 伸产物的长度。（还参见Baird,D.M.等，NatGenet.，2003, 33(2) :203-7 ;和BairdDM、 RowsonJ、Wynford_ThomasD、KiplingD.;NatGenet. ,2003,33(2):203-7.Epub2003Jan 21.PMID:12539050)
[0011] 美国专利第6, 514, 693号（Lansdorp)涉及一种用于检测形态完整的染色体、细胞 或组织切片中的核酸分子中的重复序列的多个拷贝的方法，其包括：(a)在利用变性剂的 变性条件下，用与核酸分子中的重复序列杂交且被可检测物质标记的PNA探针处理核酸分 子，以允许该探针与核酸分子中的重复序列原位杂交；和（b)通过直接或间接检测可检测 物质来鉴定与核酸分子中的重复序列杂交的所述探针，从而检测核酸分子中的重复序列的 多个拷贝。
[0012] 测定短端粒丰度的方法包括DNA印迹分析、定量荧光原位杂交（Q-FISH) (Poon，S. S.等，Cytometry, 1999, 36(4) :267-78)和改良型高通量形式的Q-FISH(HT-Q-FISH) (Canela，Α·等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2007, 104 (13) : 5300-5) 〇
[0013] 美国专利第7, 695, 904号（Cawthon)描述了使用被设计成限制非靶核酸依赖性引 发事件的核酸引物扩增靶核酸的方法。这些方法允许扩增和定量重复区域中的重复单元 数，诸如端粒重复单元数。所述专利还涉及通过qPCR方法测定生物体的平均端粒长度。
[0014]因此，尽管关于端粒的材料和方法有进步，但仍然需要用于测定染色体群体中的 短端粒丰度的量度的改良方法和材料以及使用这些量度来测定健康量度和干预的效果，这 些干预增加或减小端粒长度且因此增加或减少健康，或相反地分别减少或增加未来疾病或 死亡的风险。本发明解决了这些需求和其它需求。 发明概要
[0015]在一个方面，本发明提供一种制备核酸延伸产物的方法，其包括：i)使延伸引物 与双链染色体DNA的3'突出中的端粒重复序列杂交，其中：（1)该双链染色体DNA具有包含 端粒重复序列的端粒区域和包含亚端粒序列的亚端粒区域；且（2)该延伸引物包含：(A) 3' 部分，其在退火条件下与3'突出中的端粒重复序列杂交，和（B)具有锚定序列的5'部分， 其在退火条件下不与3'突出中的端粒重复序列杂交；以及ii)进行限时延伸反应，以使延 伸引物向双链染色体DNA的亚端粒区域延伸，其中该延伸反应被定时为仅从具有在预定长 度范围内的端粒区域的双链染色体DNA产生包含端粒重复序列和亚端粒序列的延伸产物。 在一个方面，双链染色体DNA包括具有不同长度的端粒的染色体分子。在另一方面，锚定序 列在退火条件下不与以下序列杂交：（1)具有3'突出的染色体DNA的链的亚端粒区域中的 序列；（2)在3'突出的20kb内的染色体DNA的G链中的序列；（3)在3'突出的50kb内或 20kb内的染色体DNA的G链中的序列；或（4)在双链染色体DNA中的序列。在另一方面，延 伸反应被定时为不超过30分钟、不超过10分钟、不超过5分钟、不超过4分钟、不超过3分 钟、不超过2分钟、不超过1分钟、不超过30秒、不超过20秒、不超过10秒、不超过5秒或不 超过2秒。因为引物延伸的速率可以从高（400个核苷酸/秒）变化至极低（例如50个核 苷酸/秒），所以宽泛范围的延伸时间允许评估宽泛范围的端粒长度（理论上从约100个核 苷酸至数千个核苷酸。在另一方面，延伸反应被定时为至少30分钟、至少10分钟、至少5分 钟、至少4分钟、至少3分钟、至少2分钟、至少1分钟或至少30秒。在另一方面，延伸反应 被定时为至少30分钟、至少10分钟、至少5分钟、至少4分钟、至少3分钟、至少2分钟、至 少1分钟或至少30秒。在另一方面，双链染色体DNA由固体、流体、半固体或气体样本提供。 在另一方面，染色体DNA由液体样本提供，该液体样本选自血液、唾液、尿液、血浆、血清、脑 脊液（"CSF"）或支气管肺泡灌洗液。在另一方面，染色体DNA由选自肺、肌肉或皮肤的固 体样本提供。在另一方面，染色体DNA由包括骨髓的半固体样本提供。在另一方面，染色体 DNA由包括呼气的气体样本提供。在另一方面，双链染色体DNA是脊椎动物DNA、哺乳动物 DNA或人DNA。在另一方面，延伸引物的3'部分与人端粒重复序列杂交。在另一方面，延伸 引物的3'部分包括序列5'-(CCCTAA)n-3'或其同阶排列，其中η为至少1。在另一方面，η 为至少2。在另一方面，延伸引物的5'部分包括序列：5'-TGCTCGGCCGATCTGGCATC-3'[SEQ IDN0:8]。在另一方面，延伸引物包括序列：5'-TGCTCGGCCGATCTGGCATCCCTAACC-3'[SEQID N0:7]。在另一方面，限时延伸反应采用具有链置换活性、外切核酸酶活性或链降解活性的 DNA聚合酶。在另一方面，DNA聚合酶选自T7聚合酶（例如，测序酶（Sequenase))、大肠杆 菌（E.coli)DNA聚合酶I的外切核酸酶缺乏型Klenow片段以及BstDNA聚合酶大片段和 DeepVentR(外切核酸酶）。在另一方面，第一反应利用与DNA聚合酶组合的解旋酶或具有 5' _3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶进行。
[0016]在另一方面，本发明提供一种扩增染色体的端粒重复序列和亚端粒序列的方法， 其包括：a)通过以下方式制备核酸延伸产物：i)使延伸引物与双链染色体DNA的3'突 出中的端粒重复序列杂交，其中：（1)该双链染色体DNA具有包含端粒重复序列的端粒区 域和包含亚端粒序列的亚端粒区域；且（2)该延伸引物包含：(A)3'部分，其在退火条件 下与3'突出中的端粒重复序列杂交，和（B)具有锚定序列的5'部分，其在退火条件下不 与3'突出中的端粒重复序列杂交；和ii)进行限时延伸反应，以使延伸引物向双链染色 体DNA的亚端粒区域延伸，其中该延伸反应被定时为仅从具有在预定长度范围内的端粒 区域的双链染色体DNA产生包含端粒重复序列和亚端粒序列的延伸产物；以及b)扩增该 延伸产物的以亚端粒序列和锚定序列为边界的序列；从而产生包含具有端粒重复序列和 亚端粒序列的核酸的限长扩增产物。在一个方面，使用以下各者来扩增序列：（1)第一扩 增引物，其在退火条件下与延伸产物中的亚端粒区域所独有的序列杂交；和（2)第二扩增 引物，其在退火条件下与锚定序列杂交。在另一方面，第一扩增引物包括选自以下的序列： 5'-GATGGATCCTGAGGGTGAGGGTGAGGG-3'[SEQIDN0:2]、5'-CGGGCCGGCTGAGGGTACCGCGA-3' [ SEQIDN0:10](染色体1)、5'-GCTAATGCACTCCCTCAATAC-3'[SEQIDN0:11](染色体5) 和5'-CATTCCTAATGCACACATGATACC-3'[SEQIDN0:12](染色体9)。在另一方面，第一扩增 引物包括序列5'-GATGGATCCTGAGGGTGAGGGTGAGGG-3'[SEQIDN0:2]且第二引物包括序列 5'-TGCTCGGCCGATCTGGCATC-3'[SEQIDN0:8]。扩增的端粒产物的长度范围可以通过在PCR 反应中使用限时的延伸时间来确定。在另一方面，所述方法进一步包括共扩增对照序列。在 另一方面，对照序列包括多个非端粒重复序列。在另一方面，对照序列是在体外合成或在体 内产生（例如，在细菌或真菌克隆中）。
[0017] 在另一方面，本发明提供一种用于测定短端粒丰度的方法，其包括：a)从受试者 提供包含双链染色体DNA的样本，该DNA包含3'突出；b)使用如本文（例如，上文）所描 述的本发明的扩增染色体的端粒重复序列和亚端粒序列的方法从双链染色体DNA产生限 长扩增产物；和c)测定限长扩增产物的短端粒丰度。在一个方面，所述方法进一步包括：d) 比较短端粒丰度和样本的总端粒丰度。在另一方面，短端粒是长度不超过约〇.5kb、约lkb、 约2kb、约3kb、约4kb或约5kb的端粒。在另一方面，比较包括测定作为总端粒丰度的函数 的短端粒丰度，例如短端粒丰度与总端粒丰度的比率。在另一方面，使用qPCR进行短端粒 丰度的测定。在另一方面，使用第一引物和第二引物进行qPCR，（i)其中所述第一引物与所 述第一链的至少一个重复单元杂交，且所述第二引物与所述第二链的至少一个重复单元杂 交；（ii)其中所述杂交引物在与其相应的链杂交时能够进行引物延伸，且其中当所述第一 引物与所述第一链的至少一个重复单元杂交时，所述第一引物的至少一个核苷酸在所述第 一引物与所述重复单元的核苷酸之间产生内部碱基对错配；（iii)其中当第一引物和第二 引物互相杂交时，所述第一引物还与所述第二引物的3'末端核苷酸产生错配；（iv)其中当 所述第二引物与所述第二链的至少一个重复单元杂交时，所述第二引物的至少一个核苷酸 在所述第二引物与所述重复单元的核苷酸之间产生内部碱基对错配。在另一方面，测定短 端粒丰度包括通过DNA印迹、斑点印迹、狭缝印迹、免疫化学法、核酸测序或数字PCR测量样 本中的平均端粒长度。在另一方面，短端粒丰度是相对丰度的量度。在另一方面，总端粒丰 度相对于基因组参考序列的丰度来测量。在另一方面，基因组参考序列包括单拷贝参考核 苷酸序列（例如，人β-球蛋白）或非端粒重复DNA(例如，Alu重复或着丝粒重复）的丰 度。
[0018] 在另一方面，本发明提供一种方法，其包括：a)测定来自受试者的样本中的短端 粒丰度；和b)使短端粒丰度与病状或疾病相关联。在一个方面，通过比较样本的短端粒丰 度与总端粒丰度来测定短端粒丰度的量度。在另一方面，使用本文（例如，上文）所描述的 方法测定短端粒丰度。在另一方面，病状或疾病是死亡风险。在另一方面，端粒丰度是绝对 丰度。在另一方面，绝对丰度被测量为端粒序列的长度。在另一方面，测定端粒丰度包括 通过qPCRDNA印迹、斑点印迹、狭缝印迹、免疫化学法、核酸测序和数字PCR测量样本中的 平均端粒长度。在另一方面，病状或疾病的关联与知觉应激的健康状况调查评分（Health StatusSurveyScoreofPerceivedStress)相关（参见例如Cohen,S;KamarckT和 MermelsteinR(1983)J.HealthSocialBehav. 24 (4) 385-396)。在另一方面，病理状况的 风险是疾病例如心血管疾病、糖尿病、癌症、肝纤维化和抑郁的风险。在另一方面，疾病是老 龄化疾病。在另一方面，老龄化疾病是心血管疾病且其中低于群体平均值的量度与增加的 心血管疾病风险相关联。在另一方面，所述方法包括使群体的最低的两个或三个三分位数 中的端粒丰度的量度与相较于该群体的最高三分位数中的量度显著较高的心血管疾病风 险相关联。在另一方面，所述方法包括使所述量度与端粒疾病相关联。端粒疾病可以包括 但不限于先天性角化不良、肺纤维化、再生障碍性贫血和间质性肺炎。在另一方面，所述方 法包括使所述量度与药物响应性相关联。例如，所述方法可以包括使所述量度与对他汀类 的药物响应性（其中个体的正常白血球中的短平均端粒长度与药物响应性正相关）或对伊 美司他（imetelstat) (GRN163L，癌症药物）的不良响应（其中正常白血球中的短端粒长度 与不良反应诸如血小板减少症或中性粒细胞减少症相关）相关联。在另一方面，所述方法 包括使所述量度与慢性感染诸如HIV、HCVHBV和CMV中的疾病进展和治疗结果相关联。在 另一方面，所述方法进一步包括向受试者报告相关性。在另一方面，所述方法进一步包括基 于相关性向受试者提供诊断或预后。在另一方面，所述方法进一步包括基于相关性治疗受 试者。
[0019] 在另一方面，本发明提供一种监测受试者的状况的方法，其包括：从在一段时间内 获取的多个受试者样本中的每个样本中的细胞测定短端粒丰度的量度；测定所述量度的差 异；以及使所述差异与端粒疾病的进展相关联，其中所述量度的降低指示疾病的进展。在 一个方面，通过比较样本的短端粒丰度的量度与总端粒丰度的量度来测定短端粒丰度的量 度。
[0020] 在另一方面，本发明提供一种方法，其包括：测定来自多个受试者样本的细胞中的 短端粒丰度的量度的变化速率，每个样本在不同时间获取；以及使该变化速率与以下各者 相关联：（1)健康量度；（2)病理状况的风险；（3)端粒疾病或（4)药物响应性。在一个方 面，通过比较样本的短端粒丰度的量度与总端粒丰度的量度来测定短端粒丰度的量度。
[0021] 在另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括：（1)第一扩增引物，包含：(A)3'部 分，其在退火条件下与双链染色体DNA的3'突出中的端粒重复序列杂交，和（B)具有锚定 序列的5'部分，其在退火条件下不与染色体DNA中的端粒区域中的序列或亚端粒区域中的 序列杂交；以及（2)第二扩增引物，其在退火条件下与亚端粒序列杂交。在一个方面，所述 试剂盒进一步包括：（3)第三扩增引物，其在退火条件下与锚定序列的补体杂交。在另一方 面，所述试剂盒包括：（3)用于进行短端粒测量的杂交、延伸、扩增和定量步骤的试剂。在另 一方面，所述试剂盒进一步包括：（3)包含具有已知端粒长度的染色体DNA的对照样本和参 考样本，或具有已知质量的端粒重复的合成寡核苷酸。
[0022] 通过引用并入
[0023] 本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文中，其程 度就如同每个个别的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入。
[0024] 附图简述
[0025] 图1示出了短端粒测定（STA)的总体方案。
[0026] 图2示出了通过TEL0TEST对链置换期间的短端粒扩增的