使用呈现出蛋白伴侣表达水平升高的经转化的细菌细胞在细菌无细胞合成系统中表达生 ...的制作方法
【专利说明】使用呈现出蛋白伴侣表达水平升高的经转化的细菌细胞在 细菌无细胞合成系统中表达生物学活性蛋白
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年4月19日提交的美国专利申请第61/813,914号和于2014 年2月7日提交的美国专利申请第61/937,069号的优选权的益处，其各自的公开通过引用 整体并入本文。
[0003] 涉及"序列表"、表或计算机程序的列表附录提交为ASCII文本文件
[0004] 为了所有目的，将于2014年4月16日创建的文件-58-2PC.TXT中书写的序列表 (73, 728字节，机读格式IBM-PC，MS-Windows操作系统）通过引用整体并入本文。
[0005] 发明背景
[0006] 在细菌无细胞合成系统中表达蛋白是一种用于表达重组靶蛋白的成熟建立的技 术。可从表达或过表达目标蛋白的细菌制备提取物以提供细菌无细胞合成系统，所述细菌 无细胞合成系统具有取决于所述蛋白的改变的特性。然而，细菌生长期间蛋白的过表达经 常导致细菌较慢的生长速率和从所述细菌制备的提取物中较低的蛋白合成活性。
[0007] 进一步，来自这样的提取物的重组蛋白的表达通常导致不正确的折叠和生物学活 性的损失。蛋白伴侣的使用可改善蛋白的正确折叠和其生物学活性。因此，存在对改善的 用于表达重组蛋白的细菌细胞提取物的需求，所述细菌细胞提取物从过表达蛋白伴侣的细 菌制备，其中这样的提取物可合成大量正确折叠的蛋白。如下所述，本发明满足以上这些需 求和其他需求。
[0008] 发明概述
[0009] 本公开提供用于改善无细胞合成系统中生物学活性和/或正确折叠的目标蛋白 的表达的方法和系统。所述无细胞合成系统包含细菌提取物，所述细菌提取物具有活性氧 化磷酸化系统和用于无细胞蛋白合成所需的组分。所述无细胞合成系统还包含外源蛋白伴 侣。在某些实施方案中，通过用来制备所述细菌提取物的细菌表达外源蛋白伴侣。
[0010] 因此，在一个方面，描述了改善细菌无细胞合成系统中生物学活性蛋白的表达水 平的方法，所述方法包括以下步骤：
[0011] i)制备细菌提取物，所述细菌提取物具有活性氧化磷酸化系统且包含用于无细胞 蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，其中用来制备所述提取物的细菌以至 少约lgm/升的提取物浓度表达外源蛋白伴侣；
[0012] ii)合并所述细菌提取物与编码目标蛋白的核酸，以产生细菌无细胞合成系统； 以及
[0013]iii)在允许目标蛋白的表达至浓度至少约100mg/L的条件下，孵育所述细菌无细 胞合成系统。
[0014] 在第二方面，描述了用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞合成系统，所述系统 包含：
[0015]i)细菌的无细胞提取物，所述细菌的无细胞提取物具有活性氧化磷酸化系统且含 有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，并且其中在细菌中以至 少lgm/升的提取物水平表达外源蛋白伴侣；和，
[0016] ii)编码目标蛋白的核酸，
[0017] 其中所述细菌无细胞合成系统表达目标蛋白至浓度至少约100mg/L。
[0018] 在第三方面，描述了在细菌无细胞合成系统中表达正确折叠的生物学活性蛋白的 方法，所述方法包括以下步骤：
[0019] i)制备细菌提取物，所述细菌提取物包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能 tRNA、氨基酸、核糖体，蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶，其中蛋白二硫键 异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶以足以改善正确折叠的生物学活性蛋白的表达的浓 度存在；
[0020] ii)合并所述细菌提取物与编码目标蛋白的核酸；以及
[0021] iii)在允许目标蛋白的表达和正确折叠的条件下，孵育所述细菌提取物与所述核 酸。
[0022] 在第四方面，描述了用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞合成系统，所述系统 包含：
[0023] i)细菌的无细胞提取物，所述细菌的无细胞提取物具有活性氧化磷酸化系统且含 有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，并且还包含蛋白二硫键 异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶，
[0024] 其中，所述蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶以足以改善正确折叠 的生物学活性蛋白的表达的浓度存在；和
[0025] ii)编码目标蛋白的核酸，
[0026] 其中，所述细菌无细胞合成系统表达目标蛋白至浓度至少约100mg/L。
[0027] 在第五方面，描述了改善大肠杆菌（Ecoli)细胞培养物的活力和/或生长速率的 方法，所述方法包括以下步骤：
[0028] i)用表达蛋白DsbC的核酸转化大肠杆菌，所述表达蛋白DsbC的核酸可操作地连 接组成型启动子；以及
[0029] ii)在允许过表达DsbC蛋白至胞内浓度至少lmg/ml的条件下，培养被转化的大肠 杆菌细胞。
[0030] 附图简述
[0031] 图1显示真核PDI和细菌DsbC为功能上可互换的。
[0032] 图2A显示实施例中所描述的蛋白伴侣顺序表达筛选的示意图。
[0033] 图2B显示通过将细菌无细胞系统表达的蛋白伴侣加入至细菌无细胞合成系统可 改善IgG滴度。
[0034] 图3显示蛋白伴侣Skp、SlyD和FkpA改善正确组装的IgG的溶解性和/或量。
[0035] 图4显示蛋白伴侣FkpA改善IgG蛋白的溶解性和折叠。
[0036] 图5显示将纯化的FkpA加入至含有DsbC的提取物促进IgG的折叠。
[0037] 图6显示将外源的DsbC蛋白加入至含有FkpA的提取物增加IgG滴度。
[0038] 图7显示在提取物中通过CFPS所产生的GMCSF蛋白的量，所述提取物来自表达蛋 白伴侣DsbC或FkpA的所示的菌株。
[0039] 图8显示转化有质粒的细菌菌株的生长速率，所述转化有质粒的菌株在组成型启 动子的控制下表达IX或2X拷贝的DsbC(上图）。下图显示存在于周质裂解物中的DsbC蛋 白的量。
[0040] 图9显示通过过表达IX或2X拷贝DsbC的细菌菌株所产生的DsbC蛋白的量。上 图显示细胞内浓度。下图显示提取物浓度。
[0041]图10显示转化有质粒的细菌菌株的生长速率（上图），所述转化有质粒的菌株在 组成型启动子的控制下表达IX或2X拷贝FkpA。下面左图显示存在于总提取物中的FkpA 蛋白的量，所述提取物制备自表达IX和2X拷贝FkpA的细菌。下面右图显示细菌菌株的倍 增时间。
[0042] 图11显示来自表达IX和2X拷贝FkpA的细菌的提取物中FkpA浓度的测定量。
[0043] 图12显示将C端His标签加至FkpA的结果。（a)显示通过在30 °C下提取物 活化（预孵育）后的离心旋转，增加了提取物的FkpA水平，所述提取物制备自过表达 FkpA-His(2XFkpA-His(e49))的细菌。（b)显示含有FkpA-His的提取物比含有野生型FkpA 的提取物产生更多的总IgG(比较2XFkpA(e44)与2XFkpA-His(e49))，并且通过将活化后的 提取物离心增加了正确折叠的IgG(比较最终旋转的2XFkpA与最终旋转的2XFkpA-His)。 对照（Con) 1和对照2为对照提取物，其制备自不表达FkpA的细菌。
[0044] 图13显示蛋白伴侣的过表达改善了开放式无细胞合成系统中几种IgG的产 量。㈧在SBJY001、2xDsbC和2xD+2xF提取物中，在14C-亮氨酸存在下表达曲妥珠单 抗（trastuzumab)、结合CD30抗原的布妥昔单抗（brentuximab)以及与生殖细胞系轻链 Vk3-20结合的生殖细胞系重链VH3-7和VH3-23,并且通过SDS-PAGE和放射自显影显现。 (B)如实施例所述定量不同的提取物中所表达的组装的IgG。
[0045] 定义
[0046] 除非另有定义，本文使用的技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含 义相同。参见例如，Lackie,DictionaryofCellandMolecularBiology,Elsevier(第四 版·2007);Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringsHarbor Press(ColdSpringsHarbor,NY1989);Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecular Biology,JohnWileyandSons(Hoboken,NY1995)。术语"a" 或"an" 意指"一个或多个 术语"包含（comprise)"和其变体（如"包含（comprises)"和"包括（comprising)"），当 其在所列举的步骤或元素之前时，意指其他步骤或元素的加入是任选的并且不被排除。与 本文所描述的方法、装置和材料相似或等同的任何方法、装置和材料可被用于本发明的实 践中。提供以下的定义以便于理解本文频繁使用的某些具体术语，并不意味着限制本公开 的范围。
[0047] 术语"活性氧化磷酸化系统"指在蛋白合成期间显示活性氧化磷酸化作用的细菌 裂解物。例如，所述细菌裂解物可使用ATP合成酶和氧的还原产生ATP。应理解，本领域已 知的其他翻译系统在蛋白合成期间也可使用活性氧化磷酸化作用。可通过使用具体的抑制 剂（如电子传递链抑制剂）来抑制该途径以证明氧化磷酸化作用的激活。
[0048]术语"抗体"指这样的蛋白，其在功能上被定义为结合蛋白，且结构上被定义为包 含被技术人员确认的源自产生抗体的动物的免疫球蛋白编码基因构架区的氨基酸序列。抗 体可由基本上被免疫球蛋白基因或其片段所编码的一条或多条多肽组成。被确认的免疫球 蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。 轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，其分别地依次定义免疫球蛋白 类型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
[0049] 已知典型的免疫球蛋白（抗体）的结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对完全 相同的多肽链构成，每对具有一条"轻"链（约25kD)和一条"重"链（约50_70kD)。每条 链的N端限定约100至110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语"可变的轻 链（VL) "和"可变的重链（VH) "分别指这些轻链和重链。
[0050] 抗体存在为完整的免疫球蛋白或存在为用不同的肽酶消化所产生的众多被良好 表征的片段。因此，例如胃蛋白酶在铰链区中的二硫键下方消化抗体而产生F(ab)'2(Fab 的二聚体，其自身为通过二硫键与VH-CH1连接的轻链）。在温和的条件下破坏铰链区 中的二硫键可还原F(ab)'2，从而将（Fab'）2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上 为具有部分铰链区的Fab(其他抗体片段的详细描述参见，FundamentalImmunology,W. E.Paul,ed.，RavenPress,N.Y. (1993))。虽然依据完整抗体的消化定义不同的抗体片段， 但技术人员了解，这样的Fab'片段可用化学方法或通过利用重组DNA方法重新合成。因此， 本文使用的术语"抗体"也包括通过完整抗体的修饰所产生的抗体片段或使用重组DNA方 法重新合成的抗体片段。抗体也包括单链抗体（以单条多肽链存在的抗体），和单链Fv抗 体（sFv或scFv)，在单链Fv抗体中可变的重链和可变的轻链被连接在一起（直接地或通过 肽接头）以形成连续的多肽。单链Fv抗体为共价连接的VH-VL异源二聚体，其可表达自包 含VH-和VL-编码序列的核酸，所述VH-和VL-编码序列被直接地连接或通过编码肽的接头 连接（Huston等·（1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 85:5879-5883)。虽然VH和VL彼此连接 为单一多肽链，但VH和VL结构域以非共价连接。在丝状噬菌体的表面上所表达的首个功 能性抗体分子为单链Fv'S(SCFv);然而，替代性表达策略也成功了。例如，如果链中的一条 (轻链或重链）与g3衣壳蛋白融合，且互补链导出至周质作为可溶的分子，那么可在噬菌体 上展示Fab分子。可在相同或不同的复制子上编码两条链；重点是，各个Fab分子中的两条 抗体链在翻译后组装，并且通过链中的一条与g3p的连接而将二聚体并入噬菌体颗粒（参 见，例如美国专利第5733743号）。将自然地聚集但化学上分开的来自抗体V区的轻链和 重链多肽链转变为折叠为与抗原结合位点结构基本类似的三维结构的分子的scFv抗体和 众多其他结构是本领域技术人员已知的（参见，例如美国专利第5, 091，513号、5, 132, 405 号和4, 956, 778号）。抗体也包括已在噬菌体上展示的所有的抗体（例如，scFv、Fv、Fab 和二硫键连接的Fv(Reiter等（1995)ProteinEng. 8:1323-1331)。抗体也可包括双抗体 (diantibodies)、微抗体（miniantibodies)和scFv-Fc融合体。
[0051] 术语"源于细菌的无细胞提取物"指能够将DNA转录为mRNA和/或将mRNA翻译 为多肽的体外反应混合物的制备物。所述混合物包括核糖体、ATP、氨基酸和tRNA。它们可 直接地源自裂解的细菌、源自纯化的组分或两者的组合。
[0052] 术语"细菌无细胞合成系统"指在包含生物提取物和/或指定试剂的反应混合物 中的多肽体外合成。所述反应混合物将包含用于生成大分子的模板，例如DNA、mRNA等等； 用于合成大分子的单体，例如氨基酸、核苷酸等等；以及用于合成所需的辅因子、酶和其他 试剂，例如核糖体、不带电荷的tRNA、具有非天然氨基酸的带电荷的tRNA、聚合酶、转录因 子、tRNA合成酶等等。
[0053] 术语"生物学活性蛋白"指保留目标蛋白的至少部分生物学活性的蛋白。可通过 将通过本文所描述的方法表达的目标蛋白的活性、功能和/或结构与参考目标蛋白的活性 比较，测定所述生物学活性。例如，如果参考目标蛋白为IgG，那么生物学活性蛋白将包括正 确折叠和组装的IgG分子。在某些实施方案中，参考蛋白可为通过不含有外源蛋白伴侣的 细菌无细胞合成系统所表达的蛋白。也可使用适合于目标蛋白的体外或体内检测来测定生 物学活性。目标蛋白的生物学活性可被表示为，每单位体积的无细胞蛋白合成反应混合物 的生物学活性。在某些实施方案中，通过本文所描述的方法产生的蛋白的生物学活性为参 考蛋白活性的至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或 99%。
[0054] 术语"组成型启动子"指这样的核酸序列，在适当的条件下，其允许与启动子序列 可操作地结合或连接的核酸序列或基因连续地转录。合适的条件包括转录因子和核糖核苷 酸，所述转录因子如RNA聚合酶与启动子序列结合，所述核糖核苷酸被并入转录的RNA。组 成型启动子通常为未经调节的启动子，因为它们在正常的细胞条件下促进连续的转录。
[0055] 术语"二硫键异构酶"或"蛋白二硫键异构酶（PDI) "指包含多重结构域的蛋白家 族，每个结构域具有典型的硫氧还蛋白（Trx)折叠。PDI分子具有包含CXXC基序的两个或 更多个活性位点，所述CXXC基序为用于异构酶活性的位点。在体外，根据环境的氧化还原 电位，PDI催化二硫键的氧化形成、还原或异构化。PDI为折叠催化剂类的成员，也被称为折 叠酶（foldases)。折叠催化剂通过以下步骤促进折叠：使蛋白折叠过程中某个限速步骤加 速，从而降低聚集的蛋白折叠中间物的浓度。除了催化二硫键形成的异构酶功能之外，PDI 也促进多肽折叠为它们的天然构型，并且因此作为蛋白伴侣。PDI的C端区包含多肽结合 区，并且据信其负责蛋白伴侣的活性。PDI的异构酶活性和伴侣活性为分开且独立的活性， 并且这两种活性似乎为用于含有二硫键的还原蛋白和变性蛋白的再活化所必需的。
[0056] 在革$氏阴件菌中，通讨Dsb(二硫键的形成）蛋白家族催化二硫键的形成、 还原和异构化，所述Dsb蛋白家族包括DsbA、DsbB、DsbC和DsbD。DsbA通过转移其活 性位点的二硫化物至革E蛋白来催化二硫键的氧化形成，其留下还原形式的DsbA。DsbB 使DsbA重新氧化，并且将它的电子传递至呼吸链而使氧化的DsbB再生。DsbC催化二 硫键的重新排列，并且被认为是真核Η)Ι的对应物。通过DsbD将DsbC维持在其还原 形式。DsbC为各23kDa亚基单体的同源二聚体，所述同源二聚体具有四个巯基，两个在 活性位点-CysM-Gly-Tyr-CysWYSEQIDN0:29)处，另外两个在Cys141 和Cys163处。与 PDI类似，DsbC具有独立于其异构酶活性的蛋白伴侣活性（参见，例如，Chen等，J.Biol. Chem. 274:19601-19605, 1999和Kolag，0·，等，MicrobialcellFactories, 2009,8:9)。各 个单体由具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂折叠的N端二聚化结构域和具有硫氧还蛋白折叠的C 端催化结构域组成（McCarthyA.Α·等，Nat.Struct.Biol. 7:196-199, 2000)。其他Dsb蛋 白包括DsbE和DsbG。
[0057] 术语"外源蛋白伴侣"通常指不是由用来制备细菌提取物的细菌菌株正常地表达 的蛋白伴侣（例如重组蛋白伴侣），或由不存在于天然细菌菌株中的核酸构建体表达的重 组蛋白伴侣。例如，如果用来制备细菌提取物的天然细菌菌株自然地表达低水平的内源性 蛋白伴侣（例如，不足以改善生物学活性的目标蛋白的表达水平的水平），那么可从非天然 的核酸构建体表达外源蛋白伴侣，使得编码外源蛋白伴侣的核酸序列处在与编码蛋白伴侣 的内源性序列不同的调控序列的控制下。例如，蛋白伴侣DsbC和FkpA为自然生成的大肠杆 菌蛋白，但它们的表达水平低于使用本文所描述的ELISA分析来检测细菌提取物中蛋白的 检测极限。因此，术语"外源的"与"异源的"是同义的，其指不是由用来制备细菌提取物的 细菌菌株正常地表达的蛋白伴侣，或编码不存在于天然细菌菌株中的蛋白伴侣的核酸。在 某些实施方案中，该术语指重组蛋白伴侣，其被加入至细菌无细胞提取物中，并且因此不是 由用来制备所述提取物的细菌所表达的。
[0058] 两个或更多个核酸或多肽序列的语境中的术语"同一的"、"基本上同一的"、"同一 性百分比"，指在比较窗口或指定区域内比较且比对最大一致性时，使用分别在以下文献中 所描述的BLAST和PSI-BLAST算法测定相同的或具有具体百分比的相同核苷酸或氨基酸 残基（例如，指定