蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法
【专利说明】蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 根据35U.S.C. § 119(e)，本申请要求2013年8月30日提交的美国临时专利申请 序列号61/872, 115和2013年6月11日提交的美国临时专利申请序列号61/833, 880的申 请日的优先权，该美国临时专利申请的公开内容通过引用并入本文。
[0003] 引言
[0004] 细胞修饰可用于多种不同的应用，包括研究、诊断和治疗应用。使用多种不同的方 法，包括将外源核酸和/或蛋白质引入细胞中，可以实现细胞修饰。
[0005] 蛋白质递送一一在本领域中被称为蛋白质转导，是将肽或蛋白质基序跨越质膜递 送到细胞中的过程。蛋白质递送方法包括显微注射和电穿孔。蛋白质递送方法还包括：通 过与基于脂质的试剂形成复合物而进行转染；通过与基于聚合物或肽的试剂形成复合物而 进行转染；通过纳入而将肽转导域（PTD)直接添加至感兴趣的蛋白质；病毒样颗粒介导的 引入；和外来体介导的蛋白质引入。
[0006]目前的蛋白质递送方法的一个缺点是为了转染到所需靶细胞中需要产生纯化的 蛋白质的贮存物（stock)。用于产生重组蛋白的标准方法可能呈现与溶解度、产率、正确折 叠和翻译后修饰相关的问题。这些方法也不允许重组膜蛋白的递送。这些因素中有许多是 重要的，因为它们直接涉及待转染的蛋白质的活性。对于直接递送而言，蛋白质的活性具有 最高的优先级，以使递送的蛋白质将对细胞产生影响。
[0007] 当前的方法的另一个缺点在于递送本身。由于不利的电荷差异以及低效递送和毒 性，基于脂质和聚合物/肽的转染方法具有与蛋白质特异性包装效率相关的问题。电穿孔 也已被证明具有与毒性、高水平的不一致性和对递送的蛋白质的量缺乏控制相关的问题。 PTD的纳入已知会导致聚集和沉淀，这可能会不利地影响递送效率。最后，在病毒样颗粒 (VLP)中递送蛋白质要求使用生成免疫应答的病毒衣壳蛋白进行包装。
【发明内容】
[0008] 提供了蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法。该方法的方面包括在足以从细 胞产生微泡的条件下保持细胞，该细胞具有包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白和具有第 二二聚化结构域的靶蛋白，其中该微泡包括靶蛋白。还提供了可用于制备该微泡的细胞、试 剂和试剂盒，以及例如在研究和治疗应用中使用该微泡的方法。
[0009] 附图简要说明
[0010] 图1提供了如在下面的试验部分描述的制备和使用微泡的示意图。
[0011] 图2A至2D示出了其中产生CRE重组酶微泡的本发明实施方案的多个方面并提供 了其结果。
[0012] 图3提供了微泡靶蛋白含量的测定的结果。
[0013] 详述
[0014] 提供了蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法。该方法的方面包括在足以从细 胞产生微泡的条件下保持细胞，该细胞具有包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白和具有第 二二聚化结构域的靶蛋白，其中该微泡包括靶蛋白。还提供了可用于制备该微泡的细胞、试 剂和试剂盒，以及例如在研究和治疗应用中使用该微泡的方法。
[0015] 在更详细地描述本发明之前，应该理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因 为这当然可以变化。如本领域技术人员所理解的，本发明包括各种替代、修改和等同物。还 应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并非旨在限制，因为本发明的范 围将仅由所附的权利要求来限制。
[0016] 当提供值的范围时，应当理解，本发明内包括在该范围的上限和下限之间的各居 间值，精确至下限的单位的十分之一（除非上下文清楚地另外指出），以及在该指定范围内 的任何其他指定或居间值。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内 并且还包括在本发明内，服从在所指定的范围内任何具体排除的限值。当指定的范围包括 限值的一个或两个时，排除那些包括的限值的一个或两个的范围也包括在本发明中。
[0017] 某些范围在本文中以数值前加上术语"约"来呈现。术语"约"在本文中用于对其 之后的确切数字以及与该术语之后的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是 否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其所呈现的上下 文中提供该具体列举的数字的基本等效值的数字。
[0018] 应当指出，如在本文中和在所附权利要求中所用的，单数形式"一个"、"一种"和 "该"包括复数的指示物，除非上下文另有明确规定。应进一步指出，可以将权利要求撰写为 排除任何可选的元素。这样，此声明旨在用作与权利要求元素的列举相关的排他性术语如 "单独"、"仅"等的使用或"否定"限定的使用的在先基础。
[0019] 本领域技术人员在阅读本公开内容后将会明白，在不偏离本发明的范围或精神的 情况下，本文描述和说明的各单独实施方案具有分立的组成成分和特征，其可以容易地与 任意其他几个实施方案的特征分离或组合。任何描述的方法可以以描述的事件的顺序或在 逻辑上可能的任何其他顺序进行。
[0020] 本说明书中引用的任何出版物和专利均通过引用并入本文，如同特定地且单独地 指出每个单独的出版物或专利均通过引用而并入，并通过引用而并入本文以公开和描述与 所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用都是为了其先于申请日的公开 内容且不应解释为承认本发明由于先前发明而没有资格先于此出版物。此外，所提供的出 版日期可能不同于实际的出版日期，实际的出版日期可能需要独立地加以确认。
[0021] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内普 通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法 和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但现在描述代表性的说明性方法和材料。
[0022] 制备蛋白质富集的微泡的方法
[0023] 如上所概述的，本发明的方面包括制备蛋白质富集的微泡的方法。所谓"蛋白质富 集的微泡"是指一种促融结构，其在脂双层包膜中包括一定量的一种或多种靶蛋白。如本文 所用，术语"促融"是指微泡的以下性质，其提供微泡的膜与靶细胞的膜的融合。因为微泡 是促融的，它们能够与靶细胞的脂双层膜融合，从而将其内含物（包括靶蛋白）递送至细胞 内。在进一步描述蛋白质富集的微泡之前，现在较详细地综述其制备方法。
[0024] 如上所概述的，本方法的方面包括在足以从细胞产生微泡的条件下保持产生微泡 的细胞，其中该微泡包含一种或多种靶蛋白。该产生微泡的细胞具有包含第一二聚化结构 域的膜结合蛋白和包含第二二聚化结构域的靶蛋白。
[0025] 包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白
[0026] 在制备微泡的方法中使用的细胞包括具有第一二聚化结构域的膜结合蛋白。该细 胞可以包括任何适宜的膜结合蛋白，该膜结合蛋白包括第一二聚化结构域。膜结合蛋白是 能够例如经由结合相互作用与微泡的膜稳定地结合的蛋白质，其中该膜结合蛋白当与微泡 膜相结合时可以被配置为使得该二聚化结构域与该微泡的胞质溶胶接触。膜结合蛋白可以 在大小上不同，在一些情况下范围从5kDa至250kDa，诸如10kDa至lOOkDa，包括12kDa至 50kDa〇
[0027] 该膜结合蛋白可以经修饰以包括单个二聚化结构域或者两个或更多个二聚化结 构域（例如，如下文更详细地描述）。在一些情况下，两种或更多种膜结合蛋白可以包括在 本发明的细胞和微泡中。所述两种或更多种膜结合蛋白中的每一种可独立地包括二聚化结 构域以与靶蛋白形成二聚化的复合物。
[0028] 感兴趣的膜结合蛋白包括但不限于，具有与细胞膜稳定地缔合，例如结合、整合等 的结构域（即，膜结合结构域）的任何蛋白质，其中这样的结构域可以包括肉豆蔻酰化的结 构域、法呢基化的结构域、跨膜结构域等。感兴趣的具体膜结合蛋白包括但不限于：肉豆蔻 酰化蛋白质，例如，p60v-src等；法呢基化蛋白质，例如，Ras、Rheb和CENP-E、F，结合特定 脂双层组分的蛋白质，例如膜联蛋白V，其通过结合磷脂酰丝氨酸一一细胞膜双层的脂质组 分，等等；膜锚定蛋白；跨膜蛋白，例如转铁蛋白受体及其部分；病毒膜融合蛋白，例如，如 下所述，VSV-G，等等。
[0029] 感兴趣的膜结合蛋白，除了包括膜结合结构域外，还包括第一二聚化结构域。第 一二聚化结构域可以差异很大，并且可以是直接结合靶蛋白的第二二聚化结构域或通过二 聚化介体结合第二二聚化结构域的结构域，例如，如下文更详细描述的。如需要，给定的膜 结合蛋白可以包括单一类型的给定结构域（例如，二聚化结构域、膜结合结构域等）或给 定结构域的多个拷贝，例如，2个或更多个、3个或更多个等；和/或多个不同的二聚化结构 域。如需要，给定的膜结合蛋白分子中可以存在额外的结构域，例如，连接体结构域、检测结 构域（例如，荧光蛋白，其他酶报道分子如萤光素酶等）等。在给定的膜结合蛋白中，膜结 合结构域和二聚化结构域可以是彼此异源的，使得它们不会天然地彼此缔合。因此，这样的 实施方案的膜结合蛋白不是天然存在的蛋白质。
[0030] 所述细胞可包括单种膜结合蛋白或两种或更多种不同的膜结合蛋白，例如，在希 望将两种或更多种不同的靶蛋白包装到微泡中时。因此，根据本发明的方面的产生微泡的 细胞可包括单种膜结合蛋白或两种或更多种具有不同序列的不同的膜结合蛋白，例如3种 或更多种，4种或更多种，5种或更多种，等等，其中在一些情况下，具有不同序列的不同膜 结合蛋白的数目范围为1至10种，如1至5种，包括1至4种。
[0031] 靶蛋白
[0032] 如本文所用，靶蛋白（即，感兴趣的蛋白质或Ρ0Ι)可以是希望被转移到细胞中的 任何多肽。靶蛋白可以在大小上不同，在一些情况下，其范围从5kDa至250kDa，诸如10kDa 至lOOkDa，包括12kDa至50kDa。感兴趣的革巴蛋白包括但不限于，核蛋白质、转录调节物、 DNA结合和/或修饰酶、RNA结合和/或修饰酶、蛋白质修饰酶、焚光蛋白、细胞周期调控蛋 白、激酶、结构蛋白、信号蛋白、凋亡蛋白、翻译调节物、肽抗原、胞质蛋白等。具体的感兴趣 的靶蛋白包括但不限于在下文用途部分列出的靶蛋白。
[0033] 在一些情况下，靶蛋白是内源性蛋白质。在一些情况下，靶蛋白是异源蛋白质。如 本文所用，术语"异源的"是指该蛋白质不从在用于产生微泡的细胞的基因组中天然发现的 基因来表达。靶蛋白还可以是野生型蛋白质的突变体，例如缺失突变体或点突变体，并且可 以显示功能的增加或功能的丧失，例如野生型蛋白质的显性负性突变体。靶蛋白也可以是 一个或多个蛋白质结构域的嵌合体，从而生成具有新功能的靶蛋白一一例如，Tet反式激活 蛋白，这是tet阻抑结构域和反式激活结构域的融合体，以生成通过结构域交换等获得的 新的转录调节物或蛋白质。在某些实施方案中，靶蛋白不包括任何病毒膜融合蛋白或病毒 膜融合蛋白的任何片段或保留促融性质的衍生物。具体的感兴趣的靶蛋白在下文用途部分 中进一步描述。
[0034] 所述细胞可包括单种靶蛋白或两种或更多种具有不同序列的不同的靶蛋白，其希 望被包装到微泡中。因此，根据本发明的方面的产生微泡的细胞可以包括单种靶蛋白或两 种或更多种具有不同序列的不同的靶蛋白，例如，3种或更多种、4种或更多种、5种或更多 种，等等，其中在一些情况下，不同的靶蛋白的数目范围为1至10种，例如1至5种，包括1 至4种。
[0035] 根据本发明的靶蛋白包括第二二聚化结构域。第二二聚化结构域可以差异很大， 其中第二二聚化结构域是直接地或通过（例如，如下文更详细描述的）二聚化介体与膜结 合蛋白的第一二聚化结构域二聚化（例如，直接地或通过介体，稳定地结合，例如通过非共 价键合相互作用）的结构域。给定的靶蛋白可以包括单一类型的给定的结构域（例如，二 聚化结构域）或给定结构域的多个拷贝，例如，2个或更多个，3个或更多个等。如需要，给 定的靶蛋白分子中可以存在额外的结构域，例如，连接体结构域等。在给定的靶蛋白中，该 蛋白质结构域和二聚化结构域可以是彼此异源的，使得它们不会天然地彼此缔合。因此，此 类实施方案的靶蛋白不是天然存在的蛋白质。
[0036] 二聚化结构域
[0037] 所述膜结合蛋白和靶蛋白的二聚化结构域可以变化，其中这些二聚化结构域可以 被配置为彼此直接结合或通过（例如，如下文更详细描述的）二聚化介体结合。由于膜结 合蛋白和靶蛋白各自分别包括膜结合结构域或靶蛋白结构域与二聚化结构域两者，它们可 以被看作具有彼此稳定地结合的至少两个不同的异源结构域的嵌合蛋白或融合蛋白。所谓 "异源"，是指这些嵌合蛋白的至少两个不同的结构域不天然存在于同一分子中。因此，这些 嵌合蛋白包含至少两个不同来源的不同的结构域。因为这些蛋白质的两个结构域彼此稳定 地缔合，因此在细胞条件下，例如，在细胞的表面处的条件下，在细胞内部的条件下等，它们 不会彼此解离。如需要，在给定的嵌合蛋白或融合蛋白中，两个结构域可以彼此直接地或通 过氨基酸连接体缔合。氨基酸连接体可以具有任何适宜的氨基酸序列和长度。
[0038] 关于二聚化结构