叶酸受体靶向超声造影纳米微泡及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种靶向纳米微泡，该纳米微泡可以通过被动和主动两种靶向效应准 确定位到叶酸受体高表达的肿瘤细胞，并被肿瘤细胞摄取，从而实现该肿瘤细胞的特异性 超声分子成像，本发明还涉及该纳米微泡的制备方法，属于医疗药物领域。
【背景技术】
[0002] 超声检查由于其无创无辐射、操作方便、价格低廉、对设备场地要求低等优势，是 临床诊断肿瘤的重要手段，超声造影在多年的临床应用中已经证实在肿瘤的检出和定性诊 断中有着重要的意义。超声造影优于常规造影，与CT、MRI相比拥有更多的优越性。安全高 效的超声造影剂是超声造影的基础与关键，目前临床常用的是二代微泡造影剂SonoVue即 脂质微泡造影剂，但长期的临床实践发现其对肿瘤组织的特异性不强，对病变组织缺乏亲 和力，并且由于微泡粒径大多集中在2?10iim范围内（平均粒径为3?5iim)，而毛细血 管内皮间隙约为380?780nm，因此微米级微泡是无法穿透血管内皮间隙而到达肿瘤组织 中，实际为微血管的非特异性显影，缺乏血管外肿瘤组织细胞的特异性；尽管多数肿瘤的血 供丰富，然而对于乏血供的肿瘤就容易漏检，这大大限制了声学显像对于肿瘤鉴别诊断的 效能。
[0003] 近来研究者们开始了靶向超声微泡（第三代微泡造影剂）的研究，靶向超声造影 剂是将特异性抗体或配体连接到声学造影剂表面，依靠抗原-抗体/配体-受体之间特异 性识别并结合，通过血液循环积聚到带有相应抗原/受体的靶器官或靶组织，从而使器官 或组织在超声检查中得到特异性增强。与普通微泡相比，靶向超声造影通过特异性作用于 病变区生物分子组成成分，来突出显示病变部位，从而提高超声诊断的准确性与敏感性。
[0004] 研究表明，肿瘤细胞膜表面或肿瘤供应血管表面存在着一些受体并在肿瘤组织中 存在异常表达，与相应配体或配体类似物能特异结合。受体与配体的结合具有特异性、选择 性、饱和性、亲合力强和生物效应明显的特点，为肿瘤的靶向诊治提供了靶向途径。其中叶 酸受体（folatereceptor,FR)是目前研究较多的一种，其是一种糖基化磷脂酰肌醇（GPI) 连接的膜糖蛋白，与叶酸（FA)具有高亲和力，可通过受体介导的内吞作用将叶酸（FA)摄入 细胞胞浆。叶酸受体（FR)在正常组织中的表达高度保守，FRa主要在上皮细胞系肿瘤（如 卵巢癌、结直肠癌、子宫内膜癌、睾丸癌、脑瘤、肺腺癌等）中高水平表达。虽然在正常细胞 中FR可选择性的表达在细胞表面但是其呈极性分布，血液循环中的靶向制剂不能接近该 受体，亦不能进入正常细胞，而恶性肿瘤细胞中FR分布失去极性，血液循环中的靶向制剂 可接触该受体。与大分子抗体相比，叶酸（FA)属于小分子物质，FA-FR的配体/受体结合 具有高亲和力（Kd= 10-10mol/L)，化学性质简单，易于修饰，体积小（Mr= 441. 4)，高度化 学稳定性和生物学稳定性，与有机溶剂的生理相容性，低免疫原性，达到靶点时间短、血液 清除速度快、穿透能力强、低成本等诸多优点，使得FA成为肿瘤诊断和治疗理想的靶向载 体之一，并且FA的靶向作用已经在核素PET-CT、MRI的靶向显像中得到证实。
[0005] 经检索，利用有序超分子膜层层自组装原理，构建叶酸受体介导的靶向纳米超声 造影剂未见文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种新型应用于肿瘤 细胞超声分子成像的叶酸受体靶向超声造影纳米微泡。
[0007] 本发明所要解决的又一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种新型应用 于肿瘤细胞超声分子成像的叶酸受体靶向超声造影纳米微泡的制备方法。
[0008] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种叶酸受体靶向超声造影纳米 微泡，该纳米微泡由核心模板和外壳构成，其特征在于所述的核心模板为液态氟碳纳米乳 化剂，所述的外壳为叶酸接枝聚乙二醇化壳聚糖衍生物，
[0009] 所述的液态氟碳纳米乳化剂包括如下组分及质量体积百分比浓度：
[0010] 全氟辛溴烷2.895%?4.825%; 甘油 2.25%?2.5%; 泊洛沙姆]88 0.4%~0.8%； 油酸 0.15%?0.25%; 蛋黄卵磷脂2.2%?2,6%; 其余为水。
[0011] 一种叶酸受体靶向超声造影纳米微泡的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0012] ①将甘油、泊洛沙姆188、油酸、蛋黄卵磷脂及超纯水混合配成乳化剂混悬液，将全 氟辛溴烷加入到乳化剂混悬液涡旋混合后，在超声波作用下，形成核心模板材料；
[0013] ②配置叶酸接枝聚乙二醇化壳聚糖衍生物，形成外壳材料；
[0014] ③将核心模板材料逐滴加入到外壳材料中并磁力旋转搅拌，离心，纯化水洗，灭 菌，过滤，得到产物。
[0015] 进一步，步骤①中所述的核心模板材料通过如下步骤制得：
[0016] 将甘油、泊洛沙姆188、油酸及蛋黄卵磷脂涡旋混合于超纯水中形成混悬液，该混 悬液在30?40°C条件下孵育0. 5小时至1. 5小时，形成乳状液；再涡旋混合下逐滴加入全 氟辛溴烷，定容，超声，离心，获得纳米乳化剂。
[0017] 作为优选，所述超声满足如下条件：超声用时5?15分钟，超声启动5?15秒，间 隔时间5?15秒，超声温度20?30°C。
[0018] 进一步，步骤②中所述的外壳材料通过如下步骤制得：
[0019]将叶酸（250?300mg)、N,N'-二环己基碳二亚胺（230?250mg)、N-轻基丁二酰 亚胺（120?150mg)共同溶解于二甲基亚讽（5?6ml)中，20?30°C下反应6?8小时， 生成叶酸活性酯，过滤去除沉淀，备用；
[0020] 将a-羧基-(〇-氨基聚乙二醇（0.8?1.2g)添加到上述的叶酸活性酯中，形成 羧基-聚乙二醇-叶酸；
[0021] 将羧基_聚乙二醇-叶酸在无水嘧啶中孵育2?4小时，透析24?30小时，超纯 水透析48?50小时；过滤去除不溶物，冰冻干燥获得产物羧基-聚乙二醇-叶酸；
[0022] 将壳聚糖（200?250mg)溶解于重量百分比为2%的醋酸水溶液（20?25ml)中， 获得壳聚糖醋酸水溶液，备用；
[0023] 将羧基-聚乙二醇-叶酸（200?250mg)、l_ (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚 胺盐酸盐（20?25mg)、N-轻基丁二酰亚胺（10?15mg)溶解于二甲基亚砜中，预激活4? 6小时，然后逐滴加入到前述的壳聚糖醋酸水溶液中，暗室中搅拌20?24小时直至反应完 成，生成的产物超纯水透析72?80小时，脱水，冷冻真空干燥制得叶酸-聚乙二醇-壳聚 糖干粉；
[0024] 用无水乙醇配制浓度为10mg/ml的异硫氰酸突光素溶液10?15ml，嫁接于合成 的叶酸-聚乙二醇-壳聚糖作为荧光示踪剂，2 %醋酸水溶液配制浓度为4?6mg/ml的 叶酸-聚乙二醇-壳聚糖，磁力搅拌下将上述异硫氰酸荧光素溶液逐滴加入到制备的叶 酸-聚乙二醇-壳聚糖的醋酸水溶液中，避光反应2?3h，使两者结合完成荧光标记，pH 调整为9. 0,离心去除上清，2%醋酸水溶液重悬至20ml，重复多次离心至上清无色，最后用 1 %的醋酸水溶液重悬沉淀，4-6°C叶酸-聚乙二醇-壳聚糖避光保存备用。
[0025] 进一步，所述步骤③如下：
[0026] 取制备的异硫氰酸荧光素-壳聚糖-聚乙二醇-叶酸醋酸水溶液用lmol/L的氢 氧化钠溶液调节pH至5. 5?6. 5,取核心模板材料（2?3ml)，磁力搅拌下缓慢滴加入异硫 氰酸荧光素-壳聚糖-聚乙二醇-叶酸醋酸水溶液中，搅拌，36?38 °C孵育25?35mim， 15000rpm?16000rpm高速冷冻离心（冷冻同时离心），沉淀超纯水清洗，灭菌，过滤去除杂 质
[0027] 与现有技术相比，本发明的优点在于：以液态氟碳纳米乳化剂为核心模板，以叶酸 接枝聚乙二醇化壳聚糖衍生物为外壳获得的纳米微泡具有稳定性较佳、无体外毒性作用、 静脉注射生物相容性较好、具有较高特异性结合力的优点。<