纳米金靶向标记抗体的造影剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种纳米金靶向标记抗体造影剂，以及其制备方法。本发明采用特定的连接子间接媒介，将荧光标记的抗体定向共价连接到纳米金粒子核上，从而提高了抗体的利用率，提高了造影剂的特异性和稳定性。
【专利说明】纳米金靶向标记抗体的造影剂及其制备方法
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及生物免疫【技术领域】，具体涉及一种靶向标记抗体的纳米金造影剂及其制备方法。
【【背景技术】】
[0002]分子光学造影技术在图像化分子生物标记方面表现出了光明的前景。分子光学造影技术能够达到亚细胞的分辨率并且具有实时性和对细胞无侵害性的优点。在分子光学造影技术的领域中以纳米为基础的造影剂在生物学和药学方面的应用越来越广泛。而以纳米金为载体的成像技术尤其适用于生物学领域。
[0003]由于纳米金粒子具有光学稳定性、水溶性以及无毒性，故以纳米金为载体的技术可被用于多种成像、传感及应用治疗中。现阶段，分子成像用球形的纳米金已被用于标记上皮细胞表面癌受体、还有对细胞内肌动蛋白的动力学成像。
[0004]纳米金是指金的微小颗粒，通常在水溶液中以胶体的形态存在。目前最经典的制备胶体金的方法是柠檬酸钠还原法。根据还原剂的种类和浓度的不同，可以在实验室条件下制备出不同粒径的胶体金，而且方法简单、原料价廉。胶体金在其粒径为51(T550nm的可见光谱范围内有一吸收峰，吸收波长随着金颗粒的直径增大而增加。当粒径从小到大时，表观颜色依次呈现出淡橙黄色(< 5nm)、葡萄酒红色、深红色和蓝紫色(通常为金颗粒的聚集体)的变化。
[0005]胶体金的性质主要取决于金颗粒的直径及其表面特性。由于其直径在f IOOnm之间，而大多数的生物分子(如蛋白质、核酸等)的尺寸都在这一尺度内，因此可以利用纳米金作为探针进入生物组织内部探测生物分子的生理功能，进而在分子水平上揭示生命过程，或对特异性的靶标进行检测，或利用其作靶向药物的载体等。而它独特的颜色变化也是其应用于生物化学的重要基础。
[0006]目前，许多科研单位和公司都致力于发展更精确，更灵敏，更高效，更价廉的纳米金定量或半定量的快速免疫层析技术。其原理是:利用金纳米粒子作为探针，通过抗原抗体反应，使检测信号得到放大，从而实现对抗原快速灵敏检测。
[0007]在对单细胞的研究中，尽管荧光和比色原位杂交测试已经被广泛使用，但相比于其它细胞着色方法，纳米金检测为光镜观察提供了一种优良的黑色着色方法。与荧光法相t匕，它不需要昂贵的荧光仪器，也不会随着观察时间的延长而漂白或退色。
[0008]而将纳米颗粒作为药物的携带载体是纳米金颗粒的另一项优势:将药物分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面。若同时结合靶向药物技术即在颗粒表面偶联特异性的靶向分子(如特异性配体和单克隆抗体等)，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，并在细胞摄粒作用下将药物分子引入到细胞内，就可以实现安全有效的靶向给药。
[0009]此外，随着载药纳米微粒定位问题的解决，不仅可以减少对药物不良反应，而且还可将一些特殊药物输送到机体天然的生物屏障部位，来治疗以往只能通过手术治疗的疾病。近年来，国内外学者对纳米载体在靶向药物制备中的应用进行了大量的研究。[0010]以纳米金为载体的成像技术尤其适用于生物学领域。由于纳米金粒子具有光学稳定性、水溶性以及无毒性，故以纳米金为载体的技术可被用于多种成像、传感及应用治疗中。现阶段，分子成像用球形的纳米金已被用于标记上皮细胞表面癌受体，以及对细胞内肌动蛋白的动力学成像。
[0011]在纳米金的应用治疗方面，有报到显示可使用纳米壳、纳米棒和球型纳米对癌细胞进行选择性的光热疗法。在研究一些特定分子时，可用探针分子靶向标定一些生物标记，并利用有生物标记的探针来研究这些特定分子。这些生物标记主要包括:小肽、寡核苷酸适配子、抗体或抗体片段。
[0012]其中，抗体被广泛的应用于这些识别部分，主要由于在大量已建立的生物标记中抗体具有高度的亲和性和稳定性。这其中关键的步骤即是合成分子特异性的纳米颗粒，即将探针分子与纳米颗粒结合。
[0013]纳米金抗体复合物基本上是利用抗体在其等电点处，在静电作用力下能够轻易的吸附于纳米颗粒表面，而使用高浓度的抗体与纳米金颗粒溶液共孵育来制备。然而这种方式有很多的缺陷。主要包括:在纳米金抗体复合物的制备中，抗体的浓度要求高dOug/ml)用量大，成本高；由于是利用金颗粒表面的静电作用力，故抗体在金表面的取向随机，不能保证是抗体的Fe端与纳米金粒子结合，暴露Fab端；由于抗体是以非共价键的方式吸附于纳米颗粒的表面，所以它们很容易被生物样品中其他的分子所代替。
[0014]也有利用共价策略将媒介连接子(linker)或通过抗生物素蛋白系统直接将抗体连接于纳米金颗粒表面。然而，这些技术都没有提供能够使IgG分子定向连接于纳米颗粒表面。但是，定向连接却是抗体至靶目标使其可用的功能最大化的关键。
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【发明内容】
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[0015]本发明的目的在于提供一种纳米金粒子靶向标记抗体的造影剂，能够以共价方式，将抗体定向连接到纳米金粒子表面。
[0016]本发明提供一种纳米金祀向标记抗体的造影剂,包括:纳米金粒子核；包覆纳米金粒子核并且Fab端暴露的一种或多种抗体，其中的一种抗体靶向于所要成像的分子并连接有荧光基团；通过金硫醇键连接到纳米金粒子核表面的巯基聚乙二醇化合物；以及具有下式I结构的连接子，其中，所述连接子的巯基端通过金硫醇键吸附到纳米金粒子核表面，并且所述连接子的酰肼端与抗体的Fe端或非靶位点共价连接。
[0017]
【权利要求】
1.一种纳米金祀向标记抗体的造影剂，包括: 纳米金粒子核； 包覆纳米金粒子核并且Fab端暴露的一种或多种抗体，其中的一种抗体靶向于所要成像的分子并连接有荧光基团； 通过金硫醇键连接到纳米金粒子核表面的巯基聚乙二醇化合物；以及 具有下式I结构的连接子，
2.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体造影剂，其特征在于，所述纳米金粒子的粒径为10-25nm。
3.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体造影剂，其特征在于，所要成像分子为细胞表面分子，并且所述抗体为一种。
4.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体造影剂，其特征在于，所要成像的分子为活细胞内分子，并且所述抗体有两种以上，其中的另一种抗体为抗生物素抗体，所述抗生物素抗体上还连接有抗原穿膜肽。
5.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体造影剂，其特征在于，所述巯基聚乙二醇化合物是分子量为5k Da的甲氧基-聚乙二醇-巯基。
6.一种制备权利要求1-5中任一项所述的纳米金靶向标记抗体的造影剂的方法，包括以下步骤: SI氧化抗体:在抗体溶液中添加NaIO4，室温避光孵育，之后加入磷酸盐缓冲液停止反应，得到氧化抗体溶液，其中每10-15mg抗体添加0.1mmol的NaIO4 ； S2使抗体与连接子相连:在氧化抗体溶液中添加与抗体等摩尔量的式I的连接子，室温孵育，之后加入HEPES溶液停止反应，得到抗体-连接子溶液； S3连接纳米金粒子:将抗体-连接子溶液加入纳米金粒子溶液，室温震荡孵育，添加巯基聚乙二醇化合物溶液，室温震荡孵育，得到纳米金靶向标记抗体造影剂的溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤SI中，抗体溶液的pH为7-8。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2还包括用10MWC02000g4°C过滤离心，并以HEPES溶液重悬余下溶液，以保证抗体-连接子溶液中抗体的浓度为100ug/ml。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当所要成像的分子为细胞内分子时，步骤S3还包括:在添加巯基聚乙二醇化合物溶液并在室温震荡孵育之后，添加抗原穿膜肽-聚乙二醇混合溶液，室温震荡孵育。
10.根据权利要 求6所述的方法，其特征在于，步骤S3还包括用10MWC02000g-2500g4°C过滤离心，并以HEPES溶液重悬沉淀。
【文档编号】G01N33/533GK103901191SQ201210572229
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】万晓春, 胡玉婷, 马远方, 金言 申请人:深圳先进技术研究院