eloPrimer在5' 端包含19个核苷酸的非人序列，且在3'端包含8个核苷酸的端粒序列。利用天然基因组 DNA确保了TeloPrimer将只会与端粒的3'单链尾部（突出）退火，而不与双链区域退火。 TeloPrimer的延伸是通过链置换或链降解反应实现。由于有限的时间，反应将只能够到达 那些具有短端粒的染色体上的端粒变异区，而在具有长端粒的染色体上，链置换产物将止 于完整端粒重复区域内。然后通过使用SUS引物和TeloAnchor引物进行PCR使置换的短端 粒富集。SUS引物包含3个重复的TGAGGG序列，这被发现在大多数染色体上的位于或靠近 亚端粒区与真正端粒重复之间的接合处的端粒变异区中。TeloAnchor引物与TeloPrimer共用相同的非人序列并且不含端粒序列。将SUS与TeloAnchor对设计成特异性地扩增链 置换短端粒。最后，利用TELOTESTT-运行定量短端粒的量。
[0199] 链置换产物的定量
[0200] 链置换扩增是DNA合成反应，其中所遇到的下游DNA在合成期间被聚合酶置换。 包括全基因组扩增的许多方案和法医分析使用链置换来扩增极少量的模板DNA。由于DNA 聚合酶具有链置换活性，具有缺口（nick)或单链尾部的DNA可以用作模板，而无需变性步 骤。我们选择在实验设计中使用链置换酶，因为端粒的单链尾部充当链置换酶的天然模 板，且相比5'-3'外切核酸酶（降解酶）不太可能在基因组中产生可能引起中间端粒样序 列的非特异性扩增的缺口。将TEL0PR頂ER与天然基因组DNA上的端粒的单链尾部退火使 得TeloPrimer邻近C链的5'末端（图1)。在这个设计中，链置换产物的长度将准确地反 映端粒长度。通过控制链置换时间，反应将只能够到达那些具有短端粒的染色体上的端粒 变异区。我们选择使用测序酶2. 0( -种没有外切核酸酶活性的T7DNA聚合酶的基因工程 化形式），因为据报道，它在线性模板上以高特异性和持续合成性合成DNA(Joneja，A.和 X.Huang,AnalBiochem，2011. 414(1)58-69)。我们进行时程实验，其中链置换反应耗时30 秒至5分钟。将来自膀胱癌细胞系UM-UC3的基因组DNA与TeloPrimer退火，并且如材料 与方法中所详述进行链置换反应。
[0201] 图2示出了端粒产物随着链置换反应时间的增加而增加，端粒产物是通过 TELOTESTqPCR的T-运行测量。线性回归线显示时间与扩增子丰度之间的强烈关系（R2 = 0. 99)。此外，在未添加测序酶2. 0的阴性对照中，未在TELOTESTT-运行中检测到PCR产 物（交叉点（Cp) = 25,计算浓度=1. 85E-07)，这比含测序酶2. 0的反应的最低测量浓度 低159倍。在TELOTESTS-运行中利用单拷贝基因（β-球蛋白）引物的平行反应也没有 显示扩增产物，这进一步证实了Τ-运行中测量的端粒产物衍生自链置换反应，而不是全基 因组DNA。
[0202] 我们在此提出的实验设计预测，在短的置换反应时间下，利用SUS和TeloAnchor 引物将只扩增来自短端粒的产物。我们试图通过DNA印迹分析证实该预测。使通过SUS和 TeloAnchor引物扩增得到的链置换产物在0. 5%琼脂糖凝胶上进行电泳，转移至带正电荷 的尼龙膜上，并与具有四个TTAGGG重复的DIG标记的寡核苷酸探针杂交。图3显示，扩增的 PCR产物的长度随着链置换时间的增加而增加。使用0. 5分钟、1分钟、3分钟和5分钟的置 换时间，PCR产物的估算众数（峰强度）分别为近似0. 6kb、0. 9kb、l. 2和1. 4kb。使用1分 钟的置换时间，大多数产物低于2kb。在独立的比较试验中，我们使用改良的单端粒延伸长 度分析（STELA) (Baird，D.M.等，NatGenet. ,2003. 33(2)203-7)方案来分析来自相同癌症 细胞系UM-UC3的全基因组DNA的端粒长度分布。将TeloPrimer连接至C链的5'末端，并 且使用XpYpE2和TeloAnchor引物来扩增端粒。使PCR产物在凝胶上进行电泳（图3中第1 泳道）。这表明UM-UC3端粒的众数为约1. 8kb，与先前的报道（Xu，L.和E.H.Blackburn,Mol Cell, 2007. 28 (2) 315-27) -致。
[0203] 为了进一步验证短端粒测定，我们用两种不同的基因组DNA样本进行这种 测定。除UM-UC3DNA以外，我们使用感染了慢病毒载体的UM-UC3的基因组DNA，该慢 病毒载体表达端粒酶的RNA基因hTER，从而延伸端粒（Xu，L.和E.H.Blackburn,Mol Cell, 2007. 28(2)315-27)。通过qPCR测量的UM-UC3/hTER中的平均端粒长度为2. 1，与之 相比，UM-UC3为0. 56(TelomeHealthInc.数据）。如通过DNA印迹分析（图5)所判断， UM-UC3/hTER细胞具有较低的短端粒百分比。与此一致的是，UM-UC3中的短端粒的计算量 比UM-UC3/hTER高 3 倍（图 4)。
[0204] 我们的结论是，短端粒测定特异性地测量短端粒的相对百分比。此外，通过控制链 置换反应时间，将在这个测定中测量的端粒长度截止值可以变化，且可以预定。
[0205] 上述短端粒测定可以容易地适于高通量自动化模式。图6示出了这种模式中的个 别步骤。
[0206] 尽管本文中已经显示和描述了本发明的优选方面，但对于本领域技术人员将显而 易见的是，这些方面仅作为实例而提供。众多变更、变化和替代在不脱离本公开的情况下现 在将被本领域技术人员所想到。应该理解，在实施本发明时可以采用本文所描述的本发明 的方面的各种替代物。希望以下权利要求限定本发明的范围并且在这些权利要求和其等效 物的范围内的方法和结构由此被涵盖在内。
【主权项】
1. 一种制备核酸延伸产物的方法，其包括： i) 使延伸引物与双链染色体DNA的3'突出中的端粒重复序列杂交，其中： (1) 所述双链染色体DNA具有包含端粒重复序列的端粒区域和包含亚端粒序列的亚端 粒区域；且 (2) 所述延伸引物包含： (A) 3'部分，其在退火条件下与所述3'突出中的端粒重复序列杂交，和 (B) 具有锚定序列的5'部分，其在所述退火条件下不与所述3'突出中的端粒重复序列 杂交；以及 ii) 进行限时延伸反应，以使所述延伸引物向所述双链染色体DNA的所述亚端粒区域 延伸，其中所述延伸反应被定时为仅从具有在预定长度范围内的端粒区域的双链染色体 DNA产生包含端粒重复序列和亚端粒序列的延伸产物。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述双链染色体DNA包括具有不同长度的端粒的 染色体分子。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述锚定序列在所述退火条件下不与以下中的序 列杂交： (1) 具有所述3'突出的所述染色体DNA的链的所述亚端粒区域； (2) 在所述3'突出的20kb内的所述染色体DNA的G链； (3) 在所述3'突出的50kb内或20kb内的所述染色体DNA的G链；或 (4) 所述双链染色体DNA。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述预定长度范围为0_0. 5kb、0-lkb、0-2kb、 〇-3kb、0_4kb或 0_5kb。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸反应被定时为0. 1-30分钟、0. 1-10分 钟、0. 1-5分钟、0. 1-4分钟、0. 1-3分钟、0. 1-2分钟、不超过0. 1-1分钟或0. 1-0. 5分钟。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸反应被定时为60分钟、45分钟、30分钟、 20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分 钟或0. 5分钟。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述双链染色体DNA由固体、流体、半固体或气体 样本提供。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述染色体DNA来自液体样本，所述液体样本选自 血液、唾液、尿液、血浆、血清、脑脊液（"CSF"）或支气管肺泡灌洗液。9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述染色体DNA来自选自肺、肌肉或皮肤的固体样 本。10. 根据权利要求7所述的方法，其中所述染色体DNA来自包括骨髓的半固体样本。11. 根据权利要求7所述的方法，其中所述染色体DNA由包括呼气的气体样本提供。12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述双链染色体DNA是脊椎动物DNA、哺乳动物 DNA或人DNA。13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸引物的所述3'部分与人端粒重复序列 杂交。14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸引物的所述3'部分包括序列 5' - (CCCTAA)n-3'或其同阶排列，其中η为至少1。15. 根据权利要求14所述的方法，其中η为至少2。16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸引物的所述5'部分包括以下序列： 5'-TGCTCGGCCGATCTGGCATC-3,[SEQIDN0:8]〇17. 根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸引物包括以下序列：5'-TGCTCGGCCGATC TGGCATCCCTAACC-3'[SEQIDN0:7]。18. 根据权利要求1所述的方法，其中所述限时延伸反应采用具有链置换活性、外切核 酸酶活性或链降解活性的DNA聚合酶。19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述DNA聚合酶选自改性的T7聚合酶、大肠杆 菌DNA聚合酶I的外切核酸酶缺乏型Klenow片段以及BstDNA聚合酶。20. 根据权利要求18所述的方法，其中第一反应是利用与DNA聚合酶组合的解旋酶或 具有5'-3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶进行。21. -种扩增染色体的端粒重复序列和亚端粒序列的方法，其包括： a) 通过以下方式制备核酸延伸产物： i) 使延伸引物与双链染色体DNA的3'突出中的端粒重复序列杂交，其中： (1) 所述双链染色体DNA具有包含端粒重复序列的端粒区域和包含亚端粒序列的亚端 粒区域；且 (2) 所述延伸引物包含： (A) 3'部分，其在退火条件下与所述3'突出中的端粒重复序列杂交，和 (B) 具有锚定序列的5'部分，其在所述退火条件下不与所述3'突出中的端粒重复序列 杂交；以及 ii) 进行限时延伸反应，以使所述延伸引物向所述双链染色体DNA的所述亚端粒区域 延伸，其中所述延伸反应被定时为仅从具有在预定长度范围内的端粒区域的双链染色体 DNA产生包含端粒重复序列和亚端粒序列的延伸产物；以及 b) 扩增所述延伸产物的序列； 从而产生包含具有端粒重复序列和亚端粒序列的核酸的限长扩增产物。22. 根据权利要求21所述的方法，其中使用以下各者来扩增序列： (1) 第一扩增引物，其在退火条件下与所述延伸产物中的所述亚端粒区域所独有的序 列杂交；和 (2) 第二扩增引物，其在所述退火条件下与所述锚定序列杂交。23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述第一扩增引物包括以下序列：5'-GATGGATC CTGAGGGTGAGGGTGAGGG-3'[SEQIDN0:2]、5'-CGGGCCGGCTGAGGGTACCGCGA-3'[SEQIDN0:10] (染色体 1)、5' -GCTAATGCACTCCCTCAATAC-3'[SEQIDNO: 11](染色体 5)或 5'-CATTCCTAAT GCACACATGATACC-3'[SEQIDNO: 12](染色体 9)。24. 根据权利要求22所述的方法，其中所述第一扩增引物包括序列5'-GATGGATCCTGAG GGTGAGGGTGAGGG-3'[SEQID勵:2]且所述第二引物包括序列5'16(：111^〇1^1'(^660六1'(：-3 '[SEQIDN0:8]。25. 根据权利要求21所述的方法，其中所述扩增端粒产物的长度范围可以通过在PCR 反应中使用限时的延伸时间来确定。26. 根据权利要求21所述的方法，其进一步包括共扩增对照序列。27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述对照序列包括多个非端粒重复序列。28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述对照序列为体外合成或体内产生。29. -种测定短端粒丰度的方法，其包括： a) 从受试者提供包含双链染色体DNA的样本，所述双链染色体DNA包含3'突出； b) 使用根据权利要求21所述的方法从所述双链染色体DNA产生限长扩增产物；和 c) 测定所述限长扩增产物的短端粒丰度。30. 根据权利要求29所述的方法，其进一步包括： d) 比较所述样本的所述短端粒丰度与总端粒丰度的量度。31. 根据权利要求29所述的方法，其中短端粒是长度为0. 1-0. 5kb、0.l-lkb、0.l-2kb、 0·l-3kb、0.l-4kb或 0·l-5kb的端粒。32. 根据权利要求30所述的方法，其中步骤d)包括测定作为总端粒丰度的函数的短端 粒丰度。33. 根据权利要求29所述的方法，其中测定短端粒丰度是使用qPCR进行。34. 根据权利要求33所述的方法，其中qPCR是使用第一引物和第二引物进行， i) 其中所述第一引物与所述第一链的至少一个重复单元杂交，且所述第二引物与所述 第二链的至少一个重复单元杂交， ii) 其中所述杂交引物在与其相应的链杂交时能够进行引物延伸，且其中当所述第一 引物与所述第一链的至少一个重复单元杂交时，所述第一引物的至少一个核苷酸在所述第 一引物与所述重复单元的核苷酸之间产生内部碱基对错配， iii) 其中当第一引物和第二引物互相杂交时，所述第一引物还与所述第二引物的3' 末端核苷酸产生错配， iv) 其中当所述第二引物与所述第二链的至少一个重复单元杂交时，所述第二引物的 至少一个核苷酸在所述第二引物与所述重复单元的核苷酸之间产生内部碱基对错配。35. 根据权利要求29所述的方法，其中测定短端粒丰度包括通过DNA印迹、斑点印迹、 狭缝印迹、免疫化学法、核酸测序或数字PCR测量所述样本中的平均端粒长度。36. 根据权利要求29所述的方法，其中所述短端粒丰度是相对丰度的量度。37. 根据权利要求30所述的方法，其中所述总端粒丰度是相对于基因组参考序列的丰 度来测量。38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述基因组参考序列包括单拷贝参考核苷酸序 列或非端粒重复DNA序列。39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述单拷贝参考核苷酸序列是人β-球蛋白。40. 根据权利要求38所述的方法，其中所述非端粒重复DNA序列是Alu重复序列或着 丝粒重复序列。41. 一种方法，其包括： a) 从受试者获取样本； b) 使用根据权利要求29-38中任一项所述的方法测定短端粒丰度；和 c) 使短端粒丰度与病状或疾病相关联。42. 根据权利要求41所述的方法，其中通过比较所述样本的短端粒丰度与总端粒丰度 来测定所述短端粒丰度的量度。43. 根据权利要求41所述的方法，其中所述病状或疾病是死亡风险。44. 根据权利要求41所述的方法，其中所述端粒丰度是绝对丰度。45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述绝对丰度被测量为端粒序列的长度。46. 根据权利要求41所述的方法，其中测定端粒丰度包括通过qPCRDNA印迹、斑点印 迹、狭缝印迹、免疫化学法、核酸测序或数字PCR测量所述样本中的平均端粒长度。47. 根据权利要求41所述的方法，其中所述病状或疾病是知觉应激的健康状况调查评 分。48. 根据权利要求41所述的方法，其中所述病状或疾病是疾病风险。49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述疾病风险是年龄相关疾病。50. 根据权利要求49所述的方法，其中所述年龄相关疾病是心血管疾病；且其中低于 群体平均值的量度与增加的心血管疾病风险相关联。51. 根据权利要求50所述的方法，其中测定所述短端粒丰度包括使群体的最低的两个 或三个三分位数中的短端粒丰度与相较于所述群体的最高三分位数中的量度显著较高的 心血管疾病风险相关联。52. 根据权利要求48所述的方法，其中关联短端粒丰度包括与端粒疾病相关联。53. 根据权利要求52所述的方法，其中所述端粒疾病为先天性角化不良、肺纤维化、再 生障碍性贫血或间质性肺炎。54. 根据权利要求48所述的方法，其中关联所述短端粒丰度包括与药物响应性相关 联。55. 根据权利要求54所述的方法，其中所述药物响应性是对他汀类的响应性；且其中 短端粒长度与药物响应性正相关。56. 根据权利要求54所述的方法，其中所述药物响应性是对伊美司他（GRN163L)的响 应性；且其中长端粒长度与药物响应性正相关。57. 根据权利要求48所述的方法，其中关联所述量度包括与慢性感染中的疾病进展和 治疗结果相关联。58. 根据权利要求57所述的方法，其中所述慢性感染选自HIV、HCV、HBV和CMV。59. 根据权利要求39-58中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者报告所述 相关性。60. 根据权利要求39-59中任一项所述的方法，其进一步包括基于所述相关性向所述 受试者提供诊断或预后。61. 根据权利要求39-60中任一项所述的方法，其进一步包括基于所述相关性治疗所 述受试者。62. -种用于监测受试者的状况的方法，其包括： a) 从受试者获取多个样本；其中所述样本是在一段时间内获取；且其中每个样本是在 不同的时间获取； b) 使用根据权利要求29-38中任一项所述的方法来测定所述多个样本中的每一个中 的短端粒丰度； c) 测定短端粒丰度的量度的变化率；以及 d)使所述差异与端粒疾病的进展相关联，其中所述量度的降低指示所述疾病的进展。63. 根据权利要求62所述的方法，其中通过比较所述样本的所述短端粒丰度与总端粒 丰度来测定所述短端粒丰度。64. -种方法，其包括： a) 从受试者获取多个样本；其中所述样本是在一段时间内获取；且其中每个样本是在 不同的时间获取； b) 使用根据权利要求29-38中任一项所述的方法来测定所述多个样本中的每一个中 的短端粒丰度； c) 测定短端粒丰度的量度的变化率；以及 d) 使所述变化率与以下各者相关联：（1)健康量度；（2)病理状况的风险；（3)端粒疾 病或（4)药物响应性。65. 根据权利要求64所述的方法，其中通过比较所述样本的所述短端粒丰度与总端粒 丰度来测定所述短端粒丰度。66. -种试剂盒，其包括： (1) 第一扩增引物，其包含： (A) 3'部分，其在退火条件下与双链染色体DNA的3'突出中的端粒重复序列杂交，和 (B) 具有锚定序列的5'部分，其在所述退火条件下不与所述染色体DNA中的端粒区域 中的序列或亚端粒区域中的序列杂交；以及 (2) 第二扩增引物，其在退火条件下与亚端粒序列杂交。67. 根据权利要求66所述的试剂盒，其进一步包括： (3) 第三扩增引物，其在退火条件下与所述锚定序列的补体杂交。68. 根据权利要求66所述的试剂盒，其进一步包括： (3)用于进行所述短端粒测量的杂交、延伸、扩增和定量步骤的试剂。69. 根据权利要求66所述的试剂盒，其进一步包括： (3)包含具有已知端粒长度的染色体DNA的对照样本和参考样本。
【专利摘要】本发明提供了用于从具有预定长度范围内的端粒(例如最多为一定长度的短端粒)的样本中的染色体测量端粒丰度的方法和材料。所述方法可以涉及进行被校准以从不超过限定长度的双链染色体DNA模板产生延伸产物的限时延伸反应的第一步骤；和从所述延伸产物扩增以亚端粒序列和锚定序列为边界的序列，以产生限长的端粒序列产物的第二步骤。可以测量这种产物中的端粒序列的丰度，并且可以使所述量度与各种指标相关联。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105283559
【申请号】CN201480029826
【发明人】C·哈利, J·林, Y·胡
【申请人】端粒诊断公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年5月22日
【公告号】CA2912216A1, EP2999800A2, US20160090630, WO2014190138A2, WO2014190138A3