降解未受保护的 链的酶是λ核酸外切酶。16. 权利要求1-11中任一项的方法，其中所述受保护的寡核苷酸是包含5'磷酸酯的寡 核苷酸，并且所述未受保护的寡核苷酸是不包含5'磷酸酯的寡核苷酸。17. 权利要求16的方法，其中所述能够相对于受保护的链选择性降解未受保护的链的 酶是λ核酸外切酶。18. 权利要求1-17中任一项的方法，其中所述扩增反应是PCR反应。19. 权利要求18中任一项的方法，其中所述扩增反应是易错PCR反应。20. 权利要求1-17中任一项的方法，其中所述扩增反应是等温扩增反应。21. 权利要求1-17中任一项的方法，其中所述扩增反应是滚环扩增反应。22. 权利要求1-21中任一项的方法，其中所述dsDNA变体群体的50%dsDNA变体与所 述目的序列具有小于99. 5%同一性。23. 权利要求22的方法，其中所述dsDNA变体群体的50%dsDNA变体与所述目的序列 具有小于98%同一性。24. 权利要求1-23中任一项的方法，其进一步包括在与所述能够相对于受保护的链选 择性降解未受保护的链的酶一起孵育前，纯化所述dsDNA变体群体。25. 权利要求1-24中任一项的方法，其进一步包括在与所述ssDNA中间体杂交前，纯化 所述ssDNA变体群体。26. 权利要求1-25中任一项的方法，其中所述ssDNA中间体包含与所述目的序列或其 片段具有至少50%同一性的序列。27. 权利要求26的方法，其中所述ssDNA中间体包含与所述目的序列或其片段具有至 少70%同一性的序列。28. 权利要求27的方法，其中所述ssDNA中间体包含与所述目的序列或其片段具有至 少90%同一1性的序列。29. 权利要求28的方法，其中所述ssDNA中间体包含与所述目的序列或其片段具有 100%同一性的序列。30. 权利要求1-29中任一项的方法，其中所述ssDNA中间体是包含与噬菌粒序列基本 上相同的序列片段的噬菌粒或载体。31. 权利要求1-30中任一项的方法，其中所述ssDNA变体群体与所述ssDNA中间体的 所述杂交包括所述ssDNA变体群体和所述ssDNA中间体在变性温度下的共孵育，随后逐步 冷却至退火温度。32. 权利要求31的方法，其中所述变性温度是约90°C。33. 权利要求31或32的方法，其中所述退火温度是约55°C。34. 权利要求31-33中任一项的方法，其中所述逐步冷却以约-1°C/分钟的速率发生。35. 权利要求1-34中任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞、哺乳动物细胞、昆虫细 胞、酵母细胞或细菌细胞。36. 权利要求1-35中任一项的方法，其中所述ssDNA中间体包含经修饰的核碱基，或除 腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶外的核碱基。37. 权利要求1-36中任一项的方法，其中所述细胞是能够选择性降解所述ssDNA中间 体的细胞。38. 权利要求1-37中任一项的方法，其中所述ssDNA中间体是尿嘧啶化的ssDNA中间 体。39. 权利要求1-37中任一项的方法，其中所述ssDNA中间体是甲基化的ssDNA中间体。40. 权利要求38的方法，其中所述能够选择性降解所述ssDNA中间体的细胞是Ung+细 菌细胞。41. 权利要求40的方法，其中所述细胞是TG1大肠杆菌细胞。42. 权利要求39的方法，其中所述能够选择性降解所述ssDNA中间体的细胞是Mcr+细 菌细胞。43. 权利要求1-42中任一项的方法，其中步骤（e)进一步包括通过使所述异源双链 DNA与DNA聚合酶的孵育，延伸与所述ssDNA中间体杂交的所述ssDNA变体。44. 权利要求43的方法，其中所述异源双链DNA与DNA聚合酶的所述孵育包括所述异 源双链DNA与DNA聚合酶和DNA连接酶的孵育。45. 权利要求43或44的方法，其中所述ssDNA中间体是甲基化的ssDNA中间体，并且 其中步骤（e)进一步包括使所述异源双链DNA变性，且使变性产物与选择性降解甲基化的 DNA的酶一起孵育的步骤。46. 权利要求45的方法，其中所述甲基化的ssDNA中间体包含甲基化的腺嘌呤核碱基， 并且其中所述选择性降解甲基化的DNA的酶是Dpnl。47. 权利要求43或44的方法，其中所述ssDNA变体是甲基化的，并且所述ssDNA中间 体是非甲基化的，并且其中步骤（e)进一步包括使所述异源双链DNA变性，且使变性产物与 选择性降解非甲基化的DNA的酶一起孵育的步骤。48. 权利要求47的方法，其中所述甲基化的ssDNA变体包含甲基化的胞嘧啶或鸟嘌呤 核碱基，并且其中所述选择性降解非甲基化的DNA的酶是识别DNA序列5' -GATC-3'的限制 性酶。49. 权利要求1-48中任一项的方法，其进一步包括在转化到所述细胞内之前，纯化所 述异源双链DNA。50. 权利要求1-49中任一项的方法，其中所述异源双链DNA所述转化到所述细胞内包 括两个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、或者50个或更多个所述细胞等分试样的 独立转化。51. 权利要求1-50中任一项的方法，其中所述目的序列编码抗体或其结构域或片段。52. 权利要求1-50中任一项的方法，其中所述目的序列编码蛋白酶或其结构域或片 段。53. 权利要求1-50中任一项的方法，其中所述目的序列编码酶或其结构域或片段。54. 权利要求1-53中任一项的方法，其中步骤1 (a)至1 (d)由两种或更多种不同目的 序列各自平行进行，以产生两个或更多个ssDNA变体群体，其中所述寡核苷酸、所述扩增反 应和所述酶可以在将步骤1(a)至1(d)中的任一个或全部的应用于所述两种或更多种不同 目的序列各自中不同，并且所述ssDNA变体群体在步骤1 (e)之前或期间混合。55. 权利要求54的方法，其中所述两种或更多种不同目的序列中的至少两种由单一模 板DNA分子扩增。56. 权利要求55的方法，其中所述两种或更多种不同目的序列中的全部由单一模板 DNA分子扩增。57. 权利要求54的方法，其中所述两种或更多种不同目的序列中的至少两种由不同模 板DNA分子扩增。58. 权利要求57的方法，其中所述两种或更多种不同目的序列各自由不同模板DNA分 子扩增。59. 权利要求54-58中任一项的方法，其中对于所述两种或更多种不同目的序列中的 至少两种，平行进行的一个或多个所述步骤在单一反应中进行。60. 权利要求59的方法，其中对于所述两种或更多种不同目的序列中的全部，平行进 行的一个或多个所述步骤在单一反应中进行。61. 权利要求54-58中任一项的方法，其中对于所述两种或更多种不同目的序列中的 至少两种，平行进行的一个或多个所述步骤分开进行。62. 权利要求61的方法，其中对于所述两种或更多种不同目的序列各自，平行进行的 一个或多个所述步骤分开进行。63. 权利要求54-62中任一项的方法，其中所述ssDNA中间体包含与所述两种或更多种 不同目的序列各自或其片段基本上相同的序列，并且其中步骤1(e)涵盖所述两个或更多 个ssDNA变体群体各自与所述ssDNA中间体的杂交。64. 权利要求63的方法，其中所述两个或更多个ssDNA变体群体同时与所述ssDNA中 间体杂交。65. 权利要求63的方法，其中所述两个或更多个ssDNA变体群体相继与所述ssDNA中 间体杂交。66. 通过易错PCR生成dsDNA变体群体的方法，所述方法包括下述步骤： (a) 提供包含所述目的序列的模板DNA分子； (b) 提供一对寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与所述目的序列的相反链杂交，其中所述寡 核苷酸之一包含三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包含三个或更多个5' 硫代硫酸酯，并且所述寡核苷酸侧接所述目的序列；和 (c) 使用所述寡核苷酸对所述模板DNA分子进行易错PCR，从而生成dsDNA变体群体。67. 通过易错PCR生成ssDNA变体群体的方法，所述方法包括下述步骤： (a) 提供包含所述目的序列的模板DNA分子； (b) 提供一对寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与所述目的序列的相反链杂交，其中所述寡 核苷酸之一包含三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包含三个或更多个5' 硫代硫酸酯，并且所述寡核苷酸侧接所述目的序列； (c) 使用所述寡核苷酸对所述模板DNA分子进行易错PCR，从而生成dsDNA变体群体； 和 (d) 使所述dsDNA变体群体与能够水解所述dsDNA变体的非硫代磷酸酯链、但非硫代磷 酸酯链的酶一起孵育，从而产生ssDNA变体群体。68. 通过PCR生成dsDNA分子群体的方法，所述方法包括下述步骤： (a) 提供包含所述目的序列的模板DNA分子； (b) 提供一对寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与所述目的序列的相反链杂交，其中所述寡 核苷酸之一包含三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包含三个或更多个5' 硫代硫酸酯，并且所述寡核苷酸侧接所述目的序列；和 (c) 使用所述寡核苷酸对所述模板DNA分子进行PCR，从而生成dsDNA分子群体。69. 通过PCR生成ssDNA分子群体的方法，所述方法包括下述步骤： (a) 提供包含所述目的序列的模板DNA分子； (b) 提供一对寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与所述目的序列的相反链杂交，其中所述寡 核苷酸之一包含三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包含三个或更多个5' 硫代硫酸酯，并且所述寡核苷酸侧接所述目的序列； (c) 使用所述寡核苷酸对所述模板DNA分子进行PCR，从而生成dsDNA变体分子群体； 和 (d)使所述dsDNA分子群体与能够水解所述dsDNA分子的非硫代磷酸酯链、但非硫代磷 酸酯链的酶一起孵育，从而产生ssDNA分子群体。70. 噬菌体展示方法，所述方法包括下述步骤： (a) 提供权利要求1-65中任一项的变体文库； (b) 培养所述变体文库的一个或多个等分试样，以生成培养的变体文库； (c) 使所述培养的变体文库的一个或多个等分试样与辅助噬菌体一起孵育，以生成噬 菌体展示文库，其中所述噬菌体展示文库的细胞展示由所述目的序列编码的蛋白变体； (d) 使所述噬菌体展示文库的所述细胞与靶分子接触，其中由所述目的序列编码的所 述蛋白变体中的一种或多种可以与所述靶分子相互作用；和 (e) 从所述噬菌体展示文库的所述细胞中分离展示与所述靶分子相互作用的变体蛋白 的那些细胞。71. 选择性降解非重组核酸的方法，所述方法包括： (a) 提供包含具有限制性位点的至少一个区段的第一核酸； (b) 提供包含不含所述限制性位点的至少一个区段的第二核酸； (c) 对所述第一核酸和所述第二核酸实施用于重组所述第一核酸和所述第二核酸的反 应，使得所述第一核酸的所述区段替换为所述第二核酸的所述区段，从而生成不包括所述 限制性位点的重组产物； (d) 将所述反应产物转化到表达能够切割所述限制性位点的限制性酶的细胞内；和 (e) 以足以允许由所述细胞表达的所述限制性酶切割的方式孵育所述细胞。72. 权利要求71的方法，其进一步包括测定所述细胞是否包含不含由所述限制性酶切 割的限制性位点的重组产物的步骤。73. 权利要求71的方法，其进一步包括从所述细胞中分离所述重组产物的步骤。74. 权利要求71-73中任一项的方法，其中所述限制性酶是Eco29kI。75. 权利要求71-74中任一项的方法，其中所述重组产物编码免疫球蛋白轻链和免疫 球蛋白重链，由所述第一核酸的至少一部分和所述第二核酸的至少一部分编码的所述免疫 球蛋白轻链和所述免疫球蛋白重链中的一种或多种。76. 选择性降解非诱变核酸的方法，所述方法包括： (a) 提供包含具有限制性位点的至少一个区段的第一核酸； (b) 提供具有至少一个区段的第二核酸，所述至少一个区段不含所述限制性位点，且能 够与具有所述限制性位点的所述第一核酸的至少一个区段杂交； (c) 使所述第二核酸与所述第一核酸杂交，生成异源双链DNA; (d) 分辨所述异源双链DNA，从而生成不包括所述限制性位点的产物； (e) 将所述反应产物转化到表达能够切割所述限制性位点的限制性酶的细胞内；和 (f) 以足以允许由所述细胞表达的所述限制性酶切割的方式孵育所述细胞。77. 权利要求76的方法，其进一步包括测定所述细胞是否包含不含由所述限制性酶切 害_限制性位点的产物的步骤。78. 权利要求76的方法，其进一步包括从所述细胞中分离所述产物的步骤。79. 权利要求76-78中任一项的方法，其中所述限制性酶是Eco29kI。80. 权利要求76-79中任一项的方法，其中所述产物编码免疫球蛋白轻链和免疫球蛋 白重链，由所述第二核酸的至少一部分或其序列编码的所述免疫球蛋白轻链和所述免疫球 蛋白重链中的一种或多种。81. 权利要求76-80中任一项的方法，其中所述第一核酸是ssDNA中间体，并且所述第 二核酸是ssDNA变体。82. 从诱变开放读码框选择性表达蛋白的方法，所述方法包括： (a) 提供在以其他方式能够表达的开放读码框的至少一个区段中包含一个或多个终止 密码子的第一核酸； (b) 提供包含不含终止密码子的至少一个区段的第二核酸； (c) 对所述第一核酸和所述第二核酸实施用于重组所述第一核酸和所述第二核酸的反 应，使得所述第一核酸的所述区段替换为所述第二核酸的所述区段，从而生成在所述开放 读码框中不包括终止密码子的重组产物； (d) 将所述反应的产物转化到细胞内；和 (e) 使所述细胞孵育足以允许所述开放读码框表达的时间段。83. 权利要求82的方法，其进一步包括测定所述细胞是否包含由开放读码框表达的蛋 白或其部分的步骤，所述开放读码框包含所述第一核酸的一部分的序列和所述第二核酸的 至少一部分的序列。84. 权利要求82的方法，其进一步包括从所述细胞中分离由开放读码框表达的蛋白或 其部分的步骤，所述开放读码框包含所述第一核酸的一部分的序列和所述第二核酸的至少 一部分的序列。85. 权利要求82-84中任一项的方法，其中所述重组产物编码免疫球蛋白轻链和免疫 球蛋白重链，由所述第一核酸的至少一部分和所述第二核酸的至少一部分编码的所述免疫 球蛋白轻链和所述免疫球蛋白重链中的一种或多种。86. 权利要求82-85中任一项的方法，其中所述重组反应是诱变反应，其中第一核酸是 ssDNA中间体，并且第二核酸是ssDNA变体。87. 从诱变开放读码框选择性表达蛋白的方法，所述方法包括： (a) 提供在以其他方式能够表达的开放读码框的至少一个区段中包含一个或多个终止 密码子的第一核酸； (b) 提供包含至少一个区段的第二核酸，所述至少一个区段不含终止密码子，且能够与 具有一个或多个所述终止密码子的所述第一核酸的至少一个区段杂交； (c) 使所述第二核酸与所述第一核酸杂交，生成异源双链DNA; (d) 分辨所述异源双链DNA，从而生成在所述开放读码框中不包括终止密码子的产物， (e) 将所述反应的产物转化到细胞内；和 (f) 使所述细胞孵育足以允许所述开放读码框表达的时间段。88. 权利要求87的方法，其进一步包括测定所述细胞是否包含由开放读码框表达的蛋 白或其部分的步骤，所述开放读码框包含所述第一核酸的一部分的序列和所述第二核酸的 至少一部分的序列。89. 权利要求87的方法，其进一步包括从所述细胞中分离由开放读码框表达的蛋白或 其部分的步骤，所述开放读码框包含所述第一核酸的一部分的序列和所述第二核酸的至少 一部分的序列。90. 权利要求87-89中任一项的方法，其中所述产物编码免疫球蛋白轻链和免疫球蛋 白重链，由所述第二核酸的至少一部分或其序列编码的所述免疫球蛋白轻链和所述免疫球 蛋白重链中的一种或多种。91. 权利要求87-89中任一项的方法，其中所述重组反应是诱变反应，其中第一核酸是 ssDNA中间体，并且第二核酸是ssDNA变体。
【专利摘要】本文公开的是生成例如可以用于定向进化中的目的序列的变体文库的有效方法，在一个实施方案中，该方法包括扩增反应，例如易错PCR，以生成目的序列的双链DNA(dsDNA)变体，这之后dsDNA变体的一条链可以选择性降解，以产生单链DNA(ssDNA)变体。ssDNA变体可以与ssDNA中间体例如尿嘧啶化的环状ssDNA中间体杂交，以形成异源双链DNA，其可以转化到细胞例如大肠杆菌细胞内，获得变体文库。这种方法消除无效的亚克隆步骤和由许多现有方法要求的昂贵引物组的需要。
【IPC分类】C40B40/00, C40B40/06, C40B10/00, C40B50/06
【公开号】CN105283588
【申请号】CN201480023547
【发明人】M.维纳, M.基斯
【申请人】艾希奥美公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年2月26日
【公告号】CA2902189A1, EP2961866A1, US20160032280, WO2014134166A1, WO2014134166A9