tech 公司)，把双酶切的 pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ_N0S与MNSV全基因组的2个扩增片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，涂布在含有kan抗生素的平板上，37°C培养，筛选含有甜瓜坏死斑点病毒的全长基因的载体，用碱裂解法抽取甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆PCB301-MNSV质粒载体。
[0022]一种包含上述获得的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆pCB301-MNSV质粒载体的农杆菌，其制备方法具体包括以下步骤:
通过农杆菌冻融法将植物表达载体PCB301-MNSV转入农杆菌GV3101:取200 μ 1的GV3101感受态细胞，加入1 yg的PCB301-MNSV重组载体，置于冰上30min后，液氮中速冻5min，37°C 5min，加入500 μ 1的不含有任何抗生素的LB培养基中，28°C慢速培养4_6h，涂布于含有50 μ g/ml的Km、10 μ g/ml四环素和50 μ g/ml的Rif的3种抗生素的LB固体培养基平板上28°C培养约48h，至长出单菌落；以菌落为模版，进行PCR筛选阳性克隆。
[0023]上述农杆菌注射接种及致病性鉴定
把筛选到的阳性单克隆接种到含有50 μ g/ml的Km、10yg/ml四环素和50 μ g/ml的Rif的3种抗生素的LB的液体培养集中，28°C 220rpm摇菌培养至0D600为1.0左右，经6000rpm lOmin离心收集沉淀，重悬于含有10mM MgCl2,10mM MES，150 μm的乙酰丁香酮的浸润缓冲液中，调整0D600至1.0，静置3-5h后注射接种两叶一心的甜瓜苗，接种到子叶的背部，接种后把甜瓜苗保持在黑暗中10h后，在20°C 8h，24°C 16h的条件下培养。
[0024]观察甜瓜幼苗的发病情况，检测甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体PCB301-MNSV的侵染性
接种后每天观察发病情况。接种4天后，接种的子叶开始出现局部的坏死斑点症状，至第7天时，子叶的枯斑开始连片出现，真叶也出现明显的坏死斑点症状。注射接种子叶7天后植株相继发病，接种叶出现大量枯斑，枯斑连片呈现严重枯死，出现的第一个真叶产生典型的枯斑，如图3及图4所示；同时，经酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)和RT-PCR检测，RT-PCR检测接种样品的引物扩增片段为部分CP基因590bp，引物为SEQ ID N0:06和SEQ ID N0:07 ;如图5所示，泳道1为健康对照，泳道2为接种丽SV的对照，泳道3，4为接种丽SV侵染性克隆后的样品，泳道5为DL2000的Marker，从图中可以明显看出接种丽SV侵染性克隆的大部分植株表现阳性，发病率达95%(发病37/39)。随后将发病的植株经摩擦接种回接到健康的甜瓜植株上，接种7天后植株均发病，说明构建的侵染性克隆能够正常传播。由此，MNSV侵染性克隆构建成功。
[0025]SEQIDN0:06 为
MNSV-3370F: 5 ' -ATCGTGCTGCCATTAGCTCTTATG-3 '
SEQ ID NO:07 为
MNSV-3960R: 5 ' -CAGCGAGTGA TCGTCATACG TACCC-3 ')
本发明未公开的内容为已知的现有技术，本文中不再赘述。SEQUENCE LISTING <110>中国农业科学院郑州果树研究所〈120〉甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体及其构建方法
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<170>Patentln vers1n 3.3
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<213> Melon necrotic spot virus〈400〉 8
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