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ttcattctct gtgggtaccg tcgttgcatt gactagggta cgtatgacga tcactcgctg3960ctctccggaa actgcctacc tcgcctaatt taatttactg cactccaaat ctggtctcct4020
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tgtagtgcgg tctggctaac cgtaacggcg tatcggcttg ggtcttcgat gattaggctc4140
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actctgtgtg gggcgtgcta gtggatagtc atgtatgttt gagatgggtt gtaggcccat4260
cccgccc4267
【主权项】
1.一种甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体，其特征在于:它是由甜瓜坏死斑点病毒全基因组与带35S启动子和核酶Rz的植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S重组获得甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体PCB301-MNSV。2.如权利要求1所述的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤: 1)获取甜瓜坏死斑点病毒RNA； 2)甜瓜坏死斑点病毒cDNA第一链的合成； 3)采用RT-PCR的方法分两段扩增获得甜瓜坏死斑点病毒全基因组，扩增甜瓜坏死斑点病毒基因的重组引物为:F1:5 , -AGG AAG TTC ATT TCA TTT GGA GAG G GGA TTA CTCTAG CCG GAT CCC CGA CTC-3 ' ；R1:5 ; -GAG TTC GCA TTG AAA CCC GAA TTG-3 ; ； F2:5 ' -AGC CGA CAT GGT AAG GCA CTG GAG A-3 ; ； R2:5 ; -AGG TGG AGA TGC CAT GCCGAC CC GGG CGG GAT GGG CCT ACA ACCC ATC TCA-3 ';甜瓜坏死斑点病毒基因的 5 '和3 '端分别重组了 25bp和23bp的载体序列，引物序列划线部分为与载体融合部分，F1/R1扩增1960bp的片段，F2/R2扩增2347bp的片段； 4)采用同源重组的方式将2个扩增片段与植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S重组，转化大肠杆菌DH5a，筛选并提取获得含有甜瓜坏死斑点病毒的全长基因的载体PCB301-MNSV。3.如权利要求2所述的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于步骤 2)中病毒特异性 3 '引物为:5 ' -GGG CGG GAT GGG CCT ACA ACCC ATC TCA-3 '。4.如权利要求2所述的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于步骤4)中植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S经5Y# I和Smai双酶切后与F1/R1和F2/R2扩增的甜瓜坏死斑点病毒的2个片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，涂布在含有kan抗生素的平板上，筛选含有甜瓜坏死斑点病毒的全基因组的克隆，用碱裂解法提取含有甜瓜坏死斑点病毒全长基因的克隆，获得甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体PCB301-MNSV。5.一种农杆菌，其特征在于:它是通过采用冻融法将甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pCB301-MNSV转入农杆菌GV3101感受态细胞制备得到的。6.如权利要求5所述的农杆菌的应用，其特征在于:它通过农杆菌注射法接种甜瓜幼苗检测PCB301-MNSV的侵染性。
【专利摘要】一种甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体，它是由甜瓜坏死斑点病毒全基因组与带35S启动子和核酶Rz的植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS重组获得pCB301-MNSV。通过冻融法将此载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，然后通过农杆菌注射法接种甜瓜幼苗检测pCB301-MNSV的侵染性。采用本发明的侵染性克隆载体在农杆菌中大量表达，能侵染甜瓜，西瓜和黄瓜等葫芦科作物，不侵染烟草，不感染动物和人类，相对安全，侵染性克隆的成功使对该病毒的研究易于在DNA水平上进行操作。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/82, G01N33/569, C12N1/21
【公开号】CN105296526
【申请号】CN201510554148
【发明人】吴会杰, 古勤生, 刘莉铭
【申请人】中国农业科学院郑州果树研究所
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年9月2日