鉴定、分离并使用气味和芳香受体的方法
【技术领域】
[0001] 本技术领域设及气味（odorant)和芳香受体，W及可用于鉴定气味和/或芳香化 合物的分析方法，并且更具体而言设及恶臭化合物如吗I噪或粪臭素的抑制剂或冲消剂。
【背景技术】
[0002] 嗅觉是最复杂并且最少了解的人类感觉系统之一。从嗅觉受体（OR)的激活作用 到感知，仍有许多步骤需要进一步研究。如果我们能够理解用于个体气味和混合物的OR代 码如何转化为感知，那么我们就可W利用此知识为一些领域带来显著的利益。运些领域包 括：气味调节剂，比如阻挡难闻气味的感知的恶臭冲消剂；替代不可生物降解或有毒化合 物的新的调味料和芳香成分；和气味增强剂，其将限制我们对于难W从天然来源探源化合 物的依赖性。"嗅觉代码"的组合示例W如下观察为中屯、：任何单一OR可由多种气味激活， 并且相反，多数气味能够激活少数几种OR。在小鼠基因组中，有大约1200种不同的OR。相 比之下，人类有大约400种。在运两种情形中，OR的清单由世界上数千种气味激活，而正是 运种组合的复杂性造成我们能感知的嗅觉感受的广度。然而，自2010年W来，使用传统的 脱孤法（deo巧hanization)只对于82种小鼠OR(约77% )和17种人类OR(约44% )鉴 定出气味或配体。此外，大多数的人类OR配体（主要是试管内鉴定的）的生理相关性还未 经测试。
[0003] 不同的OR脱孤法已见诸文献[例如Touhara2007Deo巧hanizingvertebrate olfactoryreceptors:Recentadvancesinodorant-responseassaysNeurochem Int51, 132-139，W及Saitoetal(2009)OdorcodingbyaMammalianrec巧tor repertoire.SciSignal2,ra9,从及Peterlinetal. (2014),TheStateoftheArtof OdorantReceptorDeorphanization:aReportfromtheOrphanage,JGenPhysiol； 143巧）：527-42]。运些方法中的许多种都特定地依赖基于细胞的分析，其中OR在适合于高 通量筛选的非嗅觉细胞中表达。然而，OR通常保持在运样的异源细胞的内质网中。因此， 如果不投放到细胞表面，运些OR就无法与气味相互作用[Minetal. (2004化ndoplasmic reticulumdegradationimpedesolfactoryG-proteincoupledreceptorfunctional expression.BMCCellBiol5, 34]。因此，一种系统的方法--其中数百至数千种不同的 细胞系，其中各细胞系均具有可用于评估气味活性的独特的OR蛋白一一对于全面解码气味 与OR之间的组合相互作用来说是不适合的方法，因为许多或大多数受体在运样的细胞系 中不能正常起作用。因此，需要新的方法，其能在生物体中存在的OR的完整列表中迅速且 可靠地鉴定出由一种或多种气味特异性地激活或抑制的OR的相对较小的子集。进一步需 要一种方法，其设及从推定OR具有全部功能的嗅觉神经元本身鉴定出0R，从而规避在非嗅 觉细胞中OR分析的公知挑战。
[0004] 恶臭化合物如吗I噪、粪臭素（3-甲基吗I噪）和对甲酪产生难闻的气味，其例如出 现于厕所和其他包含排泄物等的"浴室"来源。因此，掩盖或减少例如人对运些化合物的嗅 觉的恶臭冲消剂是所希望的。需要鉴定出气味受体，更特别而言恶臭受体。结合于吗I噪和 粪臭素的受体也已鉴定出，结合于那些受体的化合物也已被发现并报告为恶臭的潜在调节 剂。然而，由于存在于哺乳动物的众多0R，对于结合至恶臭受体，尤其是吗I噪和粪臭素受体 的受体完整列表的快速鉴定仍然是所希望的。进一步希望依赖于新的恶臭受体W鉴定出结 合至运些受体的新的有效化合物的分析。
【发明内容】
阳〇化]本文提供一种鉴定被气味或芳香化合物激活的嗅觉受体的方法，包括： 阳006] i)从非人类哺乳动物物种中将含有天然嗅觉神经元的分离的嗅觉上皮解离成单 个细胞，其中每个神经元都表达嗅觉受体；
[0007] j)给嗅觉细胞加载指示剂染料，该染料允许测定嗅觉受体的气味或芳香受体结合 活性；
[0008] k)使嗅觉受体与各气味或芳香化合物相继接触；
[0009] 1)测定由气味或芳香诱导的神经元活性的变化；
[0010] m)将被气味或芳香化合物激活的一个或多个嗅觉神经元分离；
[0011] η)扩增所分离的嗅觉受体的mRNA ;
[0012] 0)通过下一代测序技术对mRNA的转录组的至少一部分进行测序；并且
[0013]P)通过将该转录组的序列与同一物种和其他脊椎动物物种的参考基因组序列进 行比较，从而确定从由气味和芳香受体组成的群组中选出的一组嗅觉受体的同一性。
[0014] 本文还提供一种鉴定被恶臭化合物激活的嗅觉受体的方法，包括： 阳015] a)从非人类哺乳动物物种中将含有天然嗅觉神经元的分离的嗅觉上皮解离成单 个细胞，其中每个神经元都表达嗅觉受体；
[0016] b)给嗅觉细胞加载指示剂染料，该染料允许测定嗅觉受体的恶臭受体结合活性；
[0017]C)使嗅觉受体与各恶臭化合物相继接触；
[0018] d)测定由气味诱导的神经元活性的变化；
[0019]e)将被恶臭化合物激活的一个或多个嗅觉神经元分离；
[0020] f)扩增所分离的嗅觉受体的mRNA ;
[0021]g)通过下一代测序技术对mRNA的转录组的至少一部分进行测序；并且
[0022] h)通过将该转录组的序列与同一物种和其他脊椎动物物种的参考基因组序列进 行比较，从而确定一组恶臭嗅觉受体的同一性。 阳023] 本文还提供一种分离的核酸序列，其与从由如下序列构成的群组中选出的核酸序 列具有至少60%的序列同一性：SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQ IDN0:9、SEQIDN0:11、WQIDN0:13、WQIDN0:15、WQIDN0:27、WQIDN0:29、WQ IDN0:31、沈QIDN0:33、沈QIDN0:35、沈QIDN0:37、沈QIDN0:39、沈QIDN0:41、沈Q IDN0:43、沈QIDN0:45、沈QIDN0:47、沈QIDN0:49、沈QIDN0:51、沈QIDN0:53、沈Q IDN0:55、沈QIDN0:57、沈QIDN0:59、沈QIDN0:61、沈QIDN0:63、沈QIDN0:65、沈Q IDN0:67、沈QIDN0:69、沈QIDN0:71、沈QIDN0:73、沈QIDN0:75、沈QIDN0:77、沈Q IDN0:79、沈QIDN0:81、沈QIDN0:83 和沈QIDN0:85。
[0024] 本文还提供一种如上所述的分离的核酸序列，其编码多肤，该多肤与具有从由如 下序列构成的群组中选出的氨基酸序列的多肤具有至少60%的序列同一性：SEQIDN0:2、 SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、WQIDN0:12、WQIDN0:14、WQ IDNO: 16、沈QIDNO:28、沈QIDNO:30、沈QIDNO:32、沈QIDNO:34、沈QIDNO:36、沈Q IDNO:38、沈QIDNO:40、沈QIDNO:42、沈QIDNO:44、沈QIDNO:46、沈QIDNO:48、沈Q IDNO:50、沈QIDNO:52、沈QIDNO:54、沈QIDNO:56、沈QIDNO:58、沈QIDNO:60、沈Q IDNO:62、沈QIDNO:64、沈QIDNO:66、沈QIDNO:68、沈QIDNO:70、沈QIDNO:72、沈Q IDNO:74、沈QIDNO:76、沈QIDNO:78、沈QIDNO:80、沈QIDNO:82、沈QIDNO:84 和 沈QIDNO:86。
[0025] 本文还提供一种分离的多肤，其包含与从由如下序列构成的群组中选出的氨基酸 序列具有至少60%序列同一性的氨基酸序列：SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQ IDNO:8、SEQIDNO: 10、沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 14、沈QIDNO: 16、沈QIDNO:28、沈Q IDNO:30、沈QIDNO:32、沈QIDNO:34、沈QIDNO:36、沈QIDNO:38、沈QIDNO:40、沈Q IDNO:42、沈QIDNO:44、沈QIDNO:46、沈QIDNO:48、沈QIDNO:50、沈QIDNO:52、沈Q IDNO:54、沈QIDNO:56、沈QIDNO:58、沈QIDNO:60、沈QIDNO:62、沈QIDNO:64、沈Q IDNO:66、沈QIDNO:68、沈QIDNO:70、沈QIDNO:72、沈QIDNO:74、沈QIDNO:76、沈Q IDNO:78、沈QIDNO:80、沈QIDNO:82、沈QIDNO:84 和沈QIDNO:86。
[00%] 还提供一种细胞，其经重组修饰W表达如上所述的多肤。
[0027] 还提供用于鉴定结合至吗I噪和/或粪臭素气味受体的化合物的分析方法。特别 是，本文提供一种鉴定化合物的方法，该化合物阻断、抑制、调节和/或提高被从吗I噪和粪 臭素中选出的化合物激活的嗅觉受体的活性，该方法包括：
[0028]a)将该受体或嵌合体或片段与化合物接触；
[0029] b)分析该化合物是否对该受体的活性具有影响；其中，该受体为如上所述的多 肤。
[0030] 在一个实施方案中，化合物的活性是通过比较其结合至吗I噪和/或粪臭素而确定 的。在另一个实施方案中，受体与化合物是在粪臭素和/或吗I噪的存在下在允许该化合物 连同粪臭素和/或吗I噪结合至该受体的条件下接触的。
[0031] 在本文提供的进一步的实施方案中，当功能分析用于测定结合活性时，测定本文 提供的受体的信号传导活性的步骤可W包括检测第二信使水平的变化。在另一个实施方 案中，提供了信号传导活性的测定，其中，测定信号传导活性的步骤包括鸟嚷岭核巧酸结合 /偶联或交换、腺巧酸环化酶活性、环憐酸腺巧（cAMP)、蛋白激酶C活性、蛋白激酶A活性、 憐脂酷肌醇击穿、二酷基甘油、Ξ憐酸肌醇、细胞内巧、巧烙剂、花生四締酸、MAP激酶活性、 酪氨酸激酶活性、黑素细胞分析、受体初始化分析、或报道基因的表达。在本文提供的具体 实施方案中，信号传导活性的测定包括使用巧光或发光测定法。巧光和发光测定可W包括 使用化化敏感的巧光团，包括00flu03Flu0415或化ra，（分子探针）；化3-试剂盒系列 (MolecularDevice)和水母发光蛋白。
【附图说明】
[0032] 图1显示的是恶臭受体脱孤过程的示意性概述。
[003引图2显示了Ca2+成像示踪，显示了同时由吗I噪和粪臭素特异性激活的6个独立的 嗅觉感觉神经元（每个50微米）。
[0034] 图3示出了使用本文描述的步骤鉴定出的恶臭受体基因。
[0035] 图4A和图4B显示使用本文描述的步骤鉴定出的01化740(4A)和01化665(4B)族 中人与另外小鼠的恶臭受体。
[0036] 图5A至图祀示出了在肥K293T细胞中的小鼠OR01化743、01化746和01化740 的吗I噪和粪臭素的活性。
[0037]图 6A至图 6J示出 了在肥K293T细胞中的人类 0R52N2、0R11G2、0R5AC2、0R4C15、 0R8S1、0R11册和0R11H4W及小鼠01化665和01化740的吗I噪和粪臭素的活性。 阳03引 图7示出了试验化合物的肥K293T细胞中吗I噪受体01化743活性的抑制。
【具体实施方式】
[0039] 对于此处的说明书化及随附的权利要求书，除非另有说明，"或"的使用意味着'嘴 / 或"。同样，"包含"、"包括"、"含"广comprise"、"comprises"、"comprising"、"include"、 "includes"和"including")可互换使用且并非用于限制。
[0040] 还应理解的是，尽管各种实施方案的描述使用了术语"包含"，但本领域技术人员 应理解，在某些特定情形中，某实施方案可使用措辞"主要由……组成"或"由……组成"来 替代描述。 定义
[0042] 除非另有说明，如下术语具有归属于它们的含义。
[0043] "OR"是指在嗅觉细胞中表达的一族G蛋白偶联受体中的一个或多个成员。嗅觉受 体细胞还能在形态的基础上得W鉴定或通过在嗅觉细胞中特异性表达的蛋白质的表达得 W鉴定。OR族成员可具有充当嗅觉转导受体的能力。 W44]"吗I噪"和/或"粪臭素OR"是指在嗅觉细胞中表达的一族G蛋白偶联受体中的一 员，该受体在鉴定结合和/或激活GPCR的配体的结合或活性分析方法中通过吗I噪和/或粪 臭素结合和/或激活。该分析方法如下所述。本文的吗I噪和/或粪臭素受体将包括片段、 变体（包括合成的和天然存在的）和相应于或结合至吗I噪和/或粪臭素的嵌合体。 W45] "OR"核酸编码具有屯个跨膜区并具有"G蛋白偶联受体活性"的一族GPCR，例如， 它们可W响应于细胞外刺激而结合至G蛋白，并且通过酶例如憐脂酶C和腺巧酸环化酶的 刺激促进生产第二信使例如IP3、cAMP、cGMP和Ca2\
[0046] "OR"多肤被认为是运样的，它们属于屯跨膜结构域G蛋白偶联受体超家族，由单 个至化b的长外显子编码，并且表现出特性嗅觉受体特异性氨基酸基序。运屯个结构域被 称为"跨膜"或"TM"结构域TMI至TMVII，它们由Ξ个"内部细胞环"或称"1C"结构域 1CI至1CIII，化及Ξ个"外部细胞环"或称"EC"结构域ECI至ECIII连接。基序定义 为，但不限于，重叠TMIII和1CII的MAYDRYVAIC基序，重叠1CIII和TMVI的FSTCSSH 基序，TMVII中的PMLNPFIY基序，W及ECII中的Ξ个保守C残基，和TMI中高度保守GN 残基的存在（（ZhangandFirestein(2002),TheOlfactoiyRec巧torGeneSupe;rfamily oftheMouse.NatureNeuroscience:5(2):124-33；Malnicetal. ,TheHumanOlfactory Rec巧torGeneFamily:PNAS:101(8):2584-9).)。
[0047] "N末端结构域"区开始于N末端并延伸至靠近第一跨膜区的开始的区域。包括屯 个"跨膜区"的"跨膜结构域"是指位于质膜内的OR多肤的结构域，并且还可W包括相应的 细胞质（细胞内）和细胞外环。运屯个跨膜区w及细胞外和细胞质环可w使用标准方法来 鉴定，如描述于Kyte&Doolittle、J.Mol.Biol.、157:105-32 (1982)，或描述于St巧er。跨膜 结构域的一般的二级和Ξ级结构，特别是G蛋白偶联受体如嗅觉受体的屯个跨膜结构域是 本领域公知的。因此，一级结构序列可W基于已知跨膜结构域序列来设计或预测，如下面详 述。运些跨膜结构域可用于试管内配体结合分析，可溶相和固相均可。
[0048] 在调节由嗅觉转导所介导的OR族成员的测试化合物的分析方法的语境中，短语 "功能性分析"包括间接或直接在受体的影响下任何参数例如功能性、物理和化学效应的确 定。其包括配体结合、离子通量改变、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR憐酸化或去憐酸 化、信号转导的受体-配体相互作用、第二信使浓度（例如，cAMP、cGMPIP3或胞内Ca2+)、 试管内、体内和体外，并且还包括其他生理效应例如神经递质或激素释放的增加或降低。本 文所包括的是对增加或减少间接或直接在OR族成员的影响下的参数，例如功能性、物理和 化学效应的化合物的功能性分析。运种功能分析或效果可通过本领域技术人员公知的任何 手段来测定，例如，分光特性（例如，巧光、吸收度、折射率）、流体动力学（例如，形状）、色 谱或溶解度特性、膜片错、压敏染料、全细胞电流、放射性同位素流出、可诱导标记、卵母细 胞OR基因表达的变化，组织培养细胞OR表达，OR基因的转录活化，配体结合分析，电压、膜 电位和电导的变化，离子通量分析，细胞内第二信使如cAMP、cGMP和Ξ憐酸肌醇（IP3)的变 化，细胞内巧水平的变化，神经递质释放等。 W例OR基因或蛋白的"抑制剂"、"活化剂"、"冲消剂"和"调节剂"可互换使用，指的是 使用体外、试管内和体内嗅觉转导分析鉴定的抑制性、激活或调节分子，例如配体、激动剂、 括抗剂和它们的同源物和模拟物。抑制剂是例如结合、部分或完全阻断刺激、降低、防止、延 迟活化、失活、脱敏或下调嗅觉转导的化合物，例如括抗剂。活化剂是例如结合、刺激、增加、 打开激活、促进、增强激活、敏化或上调嗅觉转导的化合物，例如激动剂。调节剂包括例如改 变受体与下述物质的相互作用的化合物：结合活化剂或抑制剂的