一种冠突散囊菌株、其选育方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物和食品生物技术领域，具体设及一种冠突散囊菌株、其选育方 法及其在安化黑茶、六堡茶、普巧茶、大红袍或红茶等各类茶叶发酵过程中的应用。
【背景技术】
[0002] 冠突散囊菌，是最早从安化黑茶巧砖茶内分离鉴定得到的一种真菌。其在安化黑 茶后期发酵过程中大量繁殖，在茶叶中形成大量金黄色闭囊壳，因此又得名"金花菌"，安化 黑茶巧砖茶也有了 "发花"运一独特工序。冠突散囊菌分泌大量酶、多糖等次生代谢产物， 促进黑茶中物质充分转化，巧砖茶也因此有了特殊的"菌花香"，巧砖茶的香气、滋味、汤色 等特征鲜明。更重要的是，科研工作者发现巧砖茶的降脂、减肥，调理肠胃功效十分突出， 冠突散囊菌一方面促进巧砖茶中的物质充分转化，形成巧茶素A、B等新的活性成分，同时 冠突散囊菌的部分次生代谢产物自身也具备一定功效，对巧砖茶的功效起到叠加增强的作 用。因此，冠突散囊菌是巧砖茶感官品质和健康功效的双重"助推器"。"金花"的多少也成 为了评判巧砖茶品质优劣的第一指标，国标中和地方标准中也分别规定巧砖茶中冠突散囊 菌数量不得低于20万C化/克茶，和30万C化/克茶。必须指出，截至目前，除安化黑茶巧 砖茶可稳定发花外，在其他茶叶生产工序均没有"发花"工序。
[0003] 由于茶叶加工行业目前仍停留在传统农产品加工阶段，运些年来对"金花菌"的研 究也就都集中在传统"发花"工艺的研究，即如何通过控制溫度、湿度等自然环境因素，让冠 突散囊菌在巧砖茶中生长得更好，茶叶品质更高。显而易见，上述研究并不能达到将冠突散 囊菌运一"茶叶益生菌"推广，让更多消费者享受到"金花菌"给茶叶带来的香美和健康价 值。迄今标准化的菌种和工艺开发仍十分薄弱，没有将现代食品科技中相对成熟的微生物 及发酵技术引入茶叶生产，实现对冠突散囊菌发酵工艺的标准化控制，并在茶行业内进行 推广。
[0004] 针对上述问题，一些科研工作者已作出有益尝试和探索，但仍存在未解决的科学 和生产问题。W现有技术中公开的诸多在茶叶加工过程中使用冠突散囊菌的技术为例： 阳0化]如中国专利文献CN102524442A中公开了一种黑茶发花工艺，具体设及将黑茶原 料经渥堆、蒸茶、喷洒冠突散囊菌抱子粉，再将茶叶压制成砖，密封后高溫杀菌，冷却后茶叶 发花一段时间后烘干制成黑茶产品。但该专利没有应用菌种选育技术，使用的"冠突散囊 菌"抱子粉遗传背景不清晰，是否混有不适合茶叶发酵的其他散囊菌属菌种，甚至是其他属 微生物不清晰，运一问题普遍存在于公开的多项专利技术中。
[0006] 中国专利文献CN201310195681. 7(申请号）利用CGMCCNo. 5891进行巧砖茶的 发酵，是对茶叶发酵技术的一项突破，实现了单一菌株纯种发酵，但该菌种的选育过程不清 晰，是否能够在高溫等不利条件下快速生长，是否可W最大化缩短发酵周期，遗传稳定性是 否达到长期稳定满足工厂需求，W及该菌株是否适合其他茶叶品种发酵尚不清晰。
[0007] 除去巧砖茶外，关于冠突散囊菌在其他茶叶中的应用，也逐步开展。例如：
[0008] 中国专利文献CN200810073779公开了冠突散囊菌在六堡茶生产中的应用，具体 是在现有六堡茶生产流程基础上通过生物技术改进而来，即初蒸后，用含冠突散囊抱子悬 菌液喷洒接种；复蒸后，将茶叶菌种娠碎成沫再接种。中国专利文献CN102187920A公开 了一种接种真菌微生物制作金花普巧茶的方法，通过接种冠突散囊菌为主的混合真菌微生 物，加入发酵促进剂的方法，实现了普巧茶的发花，制备出了长有金花的金花普巧茶。中国 专利文献CN103859082B公开了一种新型的金花大红袍茶的加工工艺，其是W武夷岩茶大 红袍为原料，通过加湿和灭菌处理，向得到的茶巧中接入冠突散囊菌的抱子悬液，进行发酵 培养，发酵结束后干燥，即得金花大红袍成品。
[0009] 上述专利希望将冠突散囊菌的应用从巧砖茶扩展到其他茶类，但存在共同问题， 使用的"冠突散囊菌"抱子粉遗传背景不清晰，使用的微生物没有经过严格选育，安全性和 工厂长期使用的可行性存在问题。如何在"发花"过程中控制其他微生物的含量，避免质量 安全隐患也不明晰。而且上述菌种的应用均局限于某一茶叶品种。
[0010] 综上，本专利发明的菌种经过选育鉴定，生物学背景清晰。并且大量实验数据显示 其可成功用于上述各类"金花茶叶"的生产，不仅提高传统安化黑茶巧砖茶的产品品质，而 且能够满足各类其他"金花茶"的稳定生产，技术效果优势明显。
【发明内容】
[0011] 为此，本发明提供了一种经严格合理选育获得的冠突散囊菌菌株，可应用于各类 "金花茶叶"的生产，产品品质优秀。本发明W"单菌种发酵"为突破，实现茶叶生产的标准 化控制。
[0012] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0013] 一种冠突散囊菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、， 其保藏编号为CGMCCNO. 11304。
[0014] 一种冠突散囊菌株的选育方法，包括如下步骤：
[0015]S1、选取安化黑茶巧砖茶、广西六堡茶或普巧茶产品，取茶样粉碎成为茶粉，过60 目筛；
[0016] S2、将茶粉全部转移至无菌水中，揽拌均匀；稀释后加入无菌培养皿中，倒入溫热 的PDA固体培养基，进行倒置培养；
[0017]S3、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取菌落直径增加最快，菌落形态特征类 似于冠突散囊菌的菌落进行下一步纯化；
[0018] S4、挑取S3筛选菌落划线接种至PDA固体培养基上，于28-30°C条件下培养6-7 天，直至得到冠突散囊菌单菌落；
[0019] S5、将步骤S4获得的冠突散囊菌菌株进行筛选实验，生产可行性高，抑制杂菌能 力最强的菌株，并进行菌株鉴定及遗传稳定性分析。
[0020] 优选地，所述的步骤S5中的筛选实验如下： 阳02US51、35°C耐热生长实验：35°C，相对湿度80%，于PDA固体培养基培养7天，每日 记录菌落生长速度，选取纯化培养过程中菌落直径增长最快，生长数量最多的菌株进行第 一次保存；
[0022] S52、第一次保存的菌株，培养后进行高溫汽蒸，选取存活率最高的菌株进行第二 次保存；
[0023]S53、利用第二次保存的菌株，在相同的培养条件下，选用同一批次来源的茶叶进 行菌株接种的发酵试验，10X1〇6菌/kg茶叶密度将菌株接入茶叶，选取28°C，相对湿度 80%条件下，6天发花数量最高，出现金花时间最早，抑制杂菌能力最强的菌株。
[0024]S54、选取上述步骤筛选获得的菌株，进行形态学、分子生物学鉴定，选取鉴定结果 为冠突散囊菌，遗传稳定性稳定，符合大生产要求的菌株。
[0025] 优选地，所述步骤S52中的高溫汽蒸是在压力0. 1-0. 5Mpa、时间为10-30S。
[0026] 一种利用权利要求1所述冠突散囊菌株制备"金花茶"标准化工艺，改进或新增发 花工序，所述的发花工序包括汽蒸增湿、接种发花和干燥，所述的接种发花是W保藏编号为 CGMCCNO. 11304的冠突散囊菌菌株进行单菌种发酵。
[0027] 所述的发花工序采用的原料为生产黑茶、六堡茶、普巧茶、大红袍或红茶等各类产 品的茶叶原料或茶叶半成品。
[0028] 所述的单菌种发酵是在发花工序中接入含有所述保藏编号为CGMCCNO. 11304的 单一菌种的固体种子或者将所述菌株经液体培养得到的液体种子；
[0029] 所述汽蒸增湿是在压力0. 1-0. 5MPa条件下蒸压不超过30min，最大化降低茶叶中 微生物含量，使发花初始茶叶含水量于20% -35%;
[0030] 所述接种发花是在接种菌种后，根据产品需要进行压制，于溫度为25-35Γ，空气 相对湿度为65-85%条件下，恒溫恒湿发花6-10天。
[0031] 所述的金花茶为金花黑茶、金花六堡茶、金花普巧茶、金花大红袍、金花乌龙茶、金 花红茶、金花白茶或金花绿茶。
[0032] 所述金花黑茶的制备工艺由传统巧砖茶改进而来，还包括初制、筛分、汽蒸、发酵， 所述的发花工序优选于发酵之后；
[0033] 所述的金花六堡茶的制备工艺还包括初制、筛分、发酵、常规干燥、蒸压、鲁藏陈化 制备而成，所述的发花工序优选鲁藏陈化之后；
[0034] 所述的金花普巧茶、金花大红袍、金花红茶、金花白茶或金花绿茶等各类茶叶的制 备工艺还包括各类茶叶常规初制、精制步骤，所述发花工序置于精制之后。
[0035] 一种由所述的标准化工艺制备得到的金花茶叶，所述的金花茶叶为金花黑茶、金 花六堡茶、金花普巧茶、金花大红袍、金花乌龙茶、金花红茶、金花白茶或金花绿茶。
[0036] 本发明所述的冠突散囊菌株可用于"金花茶"标准化生产工艺，通过对传统黑茶工 艺的优化，实现安化黑茶巧砖茶品质进一步提高。并将稳定发花工序引入六堡茶、普巧茶、 大红袍或红茶