用于检测细胞迁移的微流控芯片的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，特别涉及微流控芯片。
【背景技术】
[0002] 微流控（Microfluidics)指的是使用微管道（尺寸为数十到数百微米）处理或操 纵微小流体（体积为纳升到阿升）的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物 理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。因为具有微型化、集成化等特 征，微流控装置通常被称为微流控芯片，也被称为芯片实验室（Lab on a Chip)和微全分析 系统（micro-Total Analytical System)。微流控的早期概念可以追溯到19世纪70年代 采用光刻技术在硅片上制作的气相色谱仪，而后又发展为微流控毛细管电泳仪和微反应器 等。微流控的重要特征之一是微尺度环境下具有独特的流体性质，如层流和液滴等。借助 这些独特的流体现象，微流控可以实现一系列常规方法所难以完成的微加工和微操作。目 前，微流控被认为在生物医学研究中具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景。
[0003] 细胞迀移（cell migration)也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在 接收到迀移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迀移为细胞头部伪足的延 伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迀移是正常细胞的基本功能 之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、 血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迀 移。
[0004] 申请人为重庆医科大学、申请号为201010164032. 7的中国专利介绍了一种用于 检测细胞迀移的琼脂糖凝胶微流动腔装置，包括口字型有机玻璃框及垫在所述口字型有机 玻璃框下的一块载玻片，所述口字型有机玻璃框内灌注琼脂糖凝胶；三条处于同一深度的 平行微通道贯穿于琼脂糖凝胶内，口字型有机玻璃框的两侧壁凿有导入口和导出口；进液 管和出液管通过导入口和导出口插入凝胶中，与两侧的微通道相连；本装置制作工艺简单， 密封性好，能在较短的时间内产生稳定的浓度梯度，可广泛运用于各类细胞迀移试验中。该 微流控芯片虽然能很稳定的产生浓度梯度，但是，所产生的浓度梯度为单因素的；而多因素 多维度的浓度梯度更接近体内的环境。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种微流控装置，其能够产生多维度的浓度梯度，营 造较为复杂的浓度梯度环境。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0007] -种微流控装置，包括单元A、单元B和连接所述单元A和所述单元B之间的圆环 毛细管道；所述的圆环毛细管道可以由硅胶管制成。所述单元A包括平行于同一平面的三 根通道。所述三根通道可以为圆柱体，被包埋与机制材料中。三根通道依次为高浓度液体 通道、细胞培养通道和缓冲液通道，所述三根通道在近所述圆环毛细管道端两两通过垂直 相交的侧支通道相连通，所述细胞培养通道同所述圆环毛细管道相连通；所述侧支通道可 以是毛细管，也可以不是，但所述侧支通道的半径要小于主通道（即高浓度液体通道、细胞 培养通道和缓冲液通道），其中，所述高浓度液体通道和所述缓冲液通道最好是等径。所述 单元B包括高浓度液体池和毛细管道，所述圆环毛细管道和所述高浓度液体池通过所述毛 细管道相连通。
[0008] 作为优选的方案，所述单元A由高强度琼脂糖凝胶制成，所述单元B由PDMS制成。 高强度琼脂糖凝胶可以很快速的实现浓度梯度稳定。
[0009] 作为优选的方案，所述的微流控装置所述单元A中的所述所述高浓度液体通道的 下方设置有与之平行的缓冲液通道II。
[0010] 进一步，所述的微流控装置，高浓度液体通道、缓冲液通道和缓冲液通道II均设置 有进液管道和出液管道。
[0011] 进一步，所述的微流控装置，所述单元A下方有载玻片，便于在显微镜下观察细 胞。
[0012] 进一步，所述的微流控装置，所述圆环毛细管道由透明材质制成。
[0013] 进一步，所述的微流控装置，所述细胞培养通道与所述毛细管道位于同一水平位 置，或是同一直线水平位置。
[0014] 进一步，所述的微流控装置，所述圆环毛细管道设置有刻度。刻度便于定位细胞的 迀移情况，也便于量化分析细胞迀移。
[0015] 本发明的目的之二在于提供一种检测细胞迀移的方法，该方法是利用上述微流控 装置作为检测工具的，可以实现多维度浓度梯度影响下的细胞迀移实验。
[0016] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0017] 运用所述的微流控装置检测细胞迀移的方法：
[0018] 1)在细胞培养通道中培养细胞24小时，拍照，得照片A ; -般培养24小时候，细胞 都能在细胞培养通道中较好的生长，有时候，有的细胞只需要8个小时。2)同时在所述高浓 度液体池中添加待测液体或趋化因子（含有细胞喜好的物质），同时匀速在所述高浓度液 体通道中通入所述待测液体，同时开启恒速栗在所述缓冲液通道和/或缓冲液通道II中通 入空白缓冲溶液，使琼脂糖凝胶中形成浓度梯度；通道中液体的输送可以借助恒速栗进行。 3)保持琼脂糖凝胶中的浓度梯度持续不少于8小时，观察细胞并拍照，得照片B ;4)比较照 片A和照片B中的区别。
[0019] 作为优选的方案，所述的微流控装置检测细胞迀移的方法，步骤1)中所述细胞为 血管内皮细胞。
[0020] 作为优选的方案，所述的方法步骤4)中通过比较照片A和照片B中的区别，分析 细胞迁移结果。
[0021] 本发明的有益效果在于：1)本装置可以产生多维的浓度梯度，其中，"一维"是由 高浓度液体通道和缓冲液通道中分别流动的高浓度液体和空白缓冲液体所产生的；"另一 维"是由高浓度液体通道和缓冲液通道II中分别流动的高浓度液体和空白缓冲液体所产生 的；还有"一维"是由B单元（高浓度液体池）和A单元产生的。2)本装置可以定位和统计 细胞的迀移情况，主要是圆环毛细管道设置有刻度，这样可以统计单因素、双因素或三因素 的浓度梯度情况下细胞的迀移情况，比起传统的transwell小室检测细胞迀移更科学和系 统。3)本装置检测浓度梯度可以精确到毫秒。
[0022] 更多的有益效果，详见【具体实施方式】。
【附图说明】
[0023] 图1为所述微流控装置的俯视的结构示意图。
[0024] 图2为所述微流控装置的侧视的结构示意图。
[0025] 图3为Transwell小室细胞迀移实验中含空白溶液的实验结果图。
[0026] 图4为Transwell小室细胞迀移实验中的含趋化因子溶液的实验结果图。
[0027] 图5为照片A。
[0028] 图6为照片B。
【具体实施方式】
[0029] 一微流控芯片
[0030] -种微流控装置，如图1或图2所示，包括单元A1、单元B2和连接所述单元A和 所述单元B之间的圆环毛细管道3 ;所述单元A包括平行于同一平面的三根通道，依次为高 浓度液体通道4 (直径为100 μ m)、细胞培养通道5 (直径为1mm)和缓冲液通道6 (直径为 100 μ m)，所述三根通道在近所述圆环毛细管道端两两通过垂直相交的侧支通道7相连通， 所述细胞培养通道同所述圆环毛细管道相连通；所述单元B2包括高浓度液体池8和毛细管 道9,所述圆环毛细管道和所述高浓度液体池通过所述毛细管道相连通；所述单元A由高强 度琼脂糖凝胶制成，所述单元B由PDMS制成。所述单元A中的所述所述高浓度液体通道的 下方设置有与之平行的缓冲液通道II 10 (直径为100 μ m)。高浓度液体通道4、缓冲液通道 6和缓冲液通道II 10均设置有进液管道和出液管道。所述单元A下方有载玻片。所述圆环 毛细管道由透明材质制成。所述细胞培养通道与所述毛细管道位于同一水平位置。所述圆 环毛细管道设置有刻度。
[0031] 上述装置的制备可参照申请号为201010164032. 7和201010164041. 6中提及的方 法制备。也可以直接委托微流控加工企业或实验室制作（如大连物化所）。由于微流控芯 片的制备是非常成熟且商业化的，在此就不过多的描述其制备工艺过程了。
[0032] 二浓度梯度检测
[0033] (一）一维浓度梯度的检测
[0034] 将通道各自的进液管同微注射栗相连，同高浓度液体通道4相连接的注射器中装 有按标准方法配置的荧光素溶液，同缓冲液通道6相连接的注射器中装有蒸馏水，高浓度 液体池8不填充液体，缓冲液通道II 10不连接注射栗。微注射栗的流速设定为50Ml/min， 将荧光素溶液和蒸馏水接触琼脂糖凝胶起设定为t = 0。采用倒置荧光显微镜（Olympus 1X51)拍摄通道中的荧光强度图片，
[0035] 实验前十分钟内每十分钟