拍照一次，一小时后，每5分钟拍照一次。将拍摄的照片 用Photoshop进行灰度处理，用灰度值代表荧光强度并进行数据统计。统计结果详见表1。
[0036] 表1 "一维"浓度梯度的检测
[0037]
[0038] (二）二维浓度梯度的检测
[0039] 将通道各自的进液管同微注射栗相连，同高浓度液体通道4相连接的注射器中装 有按标准方法配置的荧光素溶液，同缓冲液通道6相连接的注射器中装有蒸馏水，同缓冲 液通道II 10相连接的注射器中装有蒸馏水，高浓度液体池8不填充液体。微注射栗的流速 设定为50Ml/min，将荧光素溶液和蒸馏水接触琼脂糖凝胶起设定为t = 0。采用倒置荧光 显微镜（Olympus 1X51)拍摄通道中的荧光强度图片，实验前十分钟内每十分钟拍照一次， 一小时后，每5分钟拍照一次。将拍摄的照片用Photoshop进行灰度处理，用灰度值代表荧 光强度并进行数据统计。统计结果详见表2。
[0040] 表2 "二维"浓度梯度的检测
[0042] (三）三维浓度梯度的检测
[0043] 将通道各自的进液管同微注射栗相连，同高浓度液体通道4相连接的注射器中装 有按标准方法配置的荧光素溶液，同缓冲液通道6相连接的注射器中装有蒸馏水，同缓冲 液通道II 10相连接的注射器中装有蒸馏水，高浓度液体池8填充有按标准方法配置的荧光 素溶液（同高浓度液体通道4的相同）。微注射栗的流速设定为50ml/min，将荧光素溶液 和蒸馏水接触琼脂糖凝胶起设定为t = 0。采用倒置荧光显微镜（Olympus 1X51)拍摄通道 中的荧光强度图片，实验前十分钟内每十分钟拍照一次，一小时后，每5分钟拍照一次。将 拍摄的照片用Photoshop进行灰度处理，用灰度值代表荧光强度并进行数据统计。统计结 果详见表3。采用本装置检测浓度梯度，其时间准确性可以精确到毫秒。
[0044] 表3 "三维"浓度梯度的检测
[0045]
[0047] 三细胞迀移实验
[0048] 人内皮细胞株EA.Hy926,购自中国科学院上海生科科学研究院细胞资源中心； DMEM F12培养基，购自Invitrogen公司；胎牛血清，购自杭州四季青公司；琼脂糖凝胶，购 自Advancebiomatrx公司（美国）；PBS缓冲液，购自北京中杉金桥生物技术有限公司； Transwell 小室，购自于 Corning costar 公司。
[0049] 用吸管取2ml配制好的含10%胎牛血清的EMEM/F-12培养基轻轻加入培养瓶，注 意，吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧部。并进行细胞传代培养。
[0050] 设置实验组和对照组两个组。实验组为采用所述微流控装置进行的细胞迀移实 验。对照组为采用Transwell小室进行的细胞迀移实验。
[0051] Transwell小室实验具体为：选用槽底部膜面积为4. 76cm2,膜上小孔直径为8 μπι 的Transwell小室进行。PBS两次洗涤己贴壁的EA. hy926细胞，经胰酶消化吹散，离心收集 并计数细胞。每个迀移孔中加入含有I. 5ml含有10%胎牛血清的1640培养基，细胞收集 计数后以IxlO6/孔接种。在Transwell小室下层分别加入以体积分别为0(空白溶液）和 含体积百分浓度25%细胞喜好的趋化因子（CXCR-4)，将Transwell小室置于37°C，5% CO2 的孵箱中培养8h，将Transwell小室取出，用棉签将膜上层未迀移的细胞小心擦去，50%的 甲醇和10%乙醇固定膜45S，PBS洗膜lmin，再用甲苯胺蓝染色305, 70%乙醇脱色，100% 乙醇脱水30秒，膜在水中反复漂洗数次，显微镜下随机计数5个高倍镜视野中细胞。空白 溶液的结果如图3所示，肉眼可见仅有极少量的细胞实验的迀移。含25%细胞喜好的趋化 因子的实验结果如图4所见，肉眼可见有大量的细胞实验了迀移。但是，Transwell小室存 在的问题较多：其仅能实验上、下两室单因素的浓度差，上、下小室的势差因素及时间因素 的不可调节导致了浓度梯度不可控。随着时间的影响，上、下小室的浓度差逐渐缩小让浓度 梯度极不稳定。
[0052] 实验组：将生长状态良好的血管内皮细胞进行消化并吹散打匀，通过进液管导入 所述微流装置的所述细胞培养通道5中，放入培养箱内进行培养。每2h进行一次换液，4h 后细胞大部分贴壁。细胞在芯片内生长72h后，先通入PBS清洗5min，再通入含2 μ mol/ L Calcein AM在室温下孵育30min。
[0053] 将通道各自的进液管同微注射栗相连，同高浓度液体通道4相连接的注射器中装 有含体积百分浓度25%细胞喜好的趋化因子（CXCR-4)，同缓冲液通道6相连接的注射器中 装有PBS缓冲溶液，同缓冲液通道II 10相连接的注射器中装有PBS缓冲溶液，高浓度液体 池8填充有含体积百分浓度25%细胞喜好的趋化因子（CXCR-4)。微注射栗的流速设定为 50ml/min，将趋化因子溶液和PBS缓冲溶液接触琼脂糖凝胶起设定为t = 0。用显微镜拍 摄所述细胞培养通道5中的血管内皮细胞照片，得照片A (如图5所示）。保持琼脂糖凝胶 中的浓度梯度持续8小时，观察细胞并拍照，得照片B (如图6所示）。照片A和照片B中的 箭头指向了高浓度梯度方向。将照片A和照片B进行比较，在照片B的左上角的圆圈处，出 现了血管内皮细胞极具群。
[0054] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较 佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技 术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本 发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种微流控装置，包括单元A(1)、单元B(2)和连接所述单元A和所述单元B之间的 圆环毛细管道（3); 所述单元A包括平行于同一平面的三根通道，依次为高浓度液体通道（4)、细胞培养通 道（5)和缓冲液通道（6)，所述三根通道在近所述圆环毛细管道端两两通过垂直相交的侧 支通道（7)相连通，所述细胞培养通道同所述圆环毛细管道相连通； 所述单元B(2)包括高浓度液体池（8)和毛细管道（9)，所述圆环毛细管道和所述高浓 度液体池通过所述毛细管道相连通； 所述单元A由高强度琼脂糖凝胶制成，所述单元B由PDMS制成。2. 根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于：所述单元A中的所述，所述高浓度 液体通道的下方设置有与之平行的缓冲液通道II(10)。3. 根据权利要求2所述的微流控装置，其特征在于：高浓度液体通道（4)、缓冲液通道 (6)和缓冲液通道II(10)均设置有进液管道和出液管道。4. 根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于：所述单元A下方有载玻片。5. 根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于：所述圆环毛细管道由透明材质制 成。6. 根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于：所述细胞培养通道与所述毛细管 道位于同一水平位置。7. 根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于：所述圆环毛细管道设置有刻度。8. 运用权利要去1-7任一项所述的微流控装置检测细胞迀移的方法，其特征在于： 1) 在细胞培养通道（5)中培养细胞不少于24小时，拍照，得照片A; 2) 同时在所述高浓度液体池（8)中添加待测液体，同时匀速在所述高浓度液体通道 (4)中通入所述待测液体，同时运输在所述缓冲液通道（6)和/或缓冲液通道II(10)中通 入空白缓冲溶液，使琼脂糖凝胶中形成浓度梯度； 3) 保持琼脂糖凝胶中的浓度梯度持续不少于8小时，观察细胞并拍照，得照片B; 4) 比较照片A和照片B中的区别。9. 根据权利要求8所述的微流控装置检测细胞迀移的方法，其特征在于：步骤1)中所 述细胞为血管内皮细胞。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤4)中通过比较照片A和照片B中 的区别，分析细胞迀移结果。
【专利摘要】本发明属于生物工程领域，特别涉及微流控芯片，其包括单元A、单元B和连接所述单元A和所述单元B之间的圆环毛细管道；所述单元A包括平行于同一平面的三根通道，依次为高浓度液体通道、细胞培养通道和缓冲液通道，所述三根通道在近所述圆环毛细管道端两两通过垂直相交的侧支通道相连通，所述细胞培养通道同所述圆环毛细管道相连通；所述单元B包括高浓度液体池和毛细管道，所述圆环毛细管道和所述高浓度液体池通过所述毛细管道相连通；所述单元A由高强度琼脂糖凝胶制成，所述单元B由PDMS制成。该微流控通道可以产生多维度的浓度梯度，适用作细胞迁移装置。
【IPC分类】C12M3/00, C12Q1/02
【公开号】CN105385595
【申请号】CN201510852105
【发明人】霍峰
【申请人】内江师范学院
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月27日