但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售购买获得的常规产品。
[0040]实施例1
[0041 ]本实施例提供了PyMYBlO. 2基因的克隆方法。
[0042]SI1:采用多糖多酚RNA提取试剂盒进行"早红酥"叶片总RNA提取
[0043] 取50mg新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末，转移至1.5ml离心管中，添加500yLSL(含 25μ?3-巯基乙醇），经过去蛋白、除DNA和漂洗，最后溶解至500yLddH20中。
[0044]利用1%浓度的琼脂糖检测RNA的完整性，利用紫外分光光度计测定230nm、260nm 和280nm波长下RNA的吸光值，确定RNA的浓度和纯度。
[0045] S12：RACE-PCR
[0046] 取l-5yg的总RNA，按照SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech)的说明 书进行反转录，将反应液稀释10倍作为RACE-PCR的模板。
[0047] 根据已知花青苷调控R2R3-MYB转录因子保守区设计兼并引物（F:5'-TGY ATHRAYAARTAYGGIGARGGIAARTGG-3'，R:5'-GTRTTCCARTARTTYTTIACRTCRTTNGC-3'）。
[0048]PCR反应体系：总体积50yL，包括cDNA模板2yL，0.2mM dNTP，ΙμΜ兼并引物，1 X Ex Taq Buffer,1U Ex Taq(Takara)〇
[0049] 反应程序为：
[0050]① 94°C 2min
[0051]②94°C 30s
[0052]③ 45°C 30s
[0053]④ 72°C lmin
[0054]⑤go to②③④for 35个循环
[0055]⑥ 72°C 5min
[0056]⑦4°C保存
[0057] PCR产物纯化回收，片段大小约为250bp。
[0058] 将回收片段连接至pMD18_T(Takara)克隆载体，转化至DH5a中，在含氨苄青霉素的 LB培养基培养(LB培养基的配方为：1L培养基中含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化 钠和12g琼脂），取阳性克隆送上海生物工程有限公司测序。将测序结果进行BLAST分析，选 择与已知花青苷调R2R3-MYB转录因子同源性高的序列进行RACE-PCR扩增。
[0059]用于3 'RACE的引物为F:GCACTTCGTTCAACAGCATGGTG，用于5 'RACE的引物为R: CCTACTAGTTTGCGAAGTCTGATC，UPM通用引物由RACE试剂盒提供。按照SMARTRACEcDNA AmplificationKit的说明书进行5'和3'RACEPCR扩增。将获得的PCR产物纯化回收、克隆 测序。对5 '和3 '序列进行比对拼接。设计特异引物F:ATGGAAGAGCGTAATTCGTTGGGAG，R: TCAAATACATGCTTTTGAGTTGTTC，扩增基因全长。
[0060]PCR反应体系总体积50yL，包括2yLcDNA模板，0.2mM(1ΝΤΡ，1μΜ特异引物，5yLTaq Buffer，1UTaq酶(Takara)。反应程序为：
[0061]①94°C 2min
[0062]② 94°C 30s
[0063]③ 56°C 30s
[0064]④ 72°G lmin
[0065]⑤go to②③④for 35个循环
[0066]⑥ 72°C lOmin
[0067]⑦4〇C保存
[0068] PCR产物纯化回收，克隆测序。利用NCBI0RFfinder确定获得的基因具有完整的 开放读码框(序列为SEQIDN0:1)，并推导出其编码的氨基酸序列(序列为SEQIDN0:2)。
[0069] S13、序列比对分析
[0070] 对分离的基因序列进行序列分析，发现该序列含有保守的R2R3-MYB结构域，在R3- MYB结构域中有bHLH结合域。Blastx分析发现它与花青苷调控R2R3-MYB转录因子同源性最 高，与AtMYB90有39%的相似性，与PyMYBlO和PyMYBlO. 1的相似性分别为32.7%和43.4%。 认为分离了PyMYB10新的同源基因，命名为PyMYB10.2。进化树将PyMYB10.2与花青苷调控 R2R3-MYB转录因子聚为一类(如图1所示）。
[0071] 实施例2
[0072]为了检测PyMYB10.2对花青苷结构基因AtDFR是否具有调控能力，本申请在实施例 2中提供了双荧光素酶检测试验。
[0073]本试验使用的转录因子为梨PyMYB 10.2、拟南芥AtbHLH2和杨梅MrbHLHl，使用的启 动子为拟南芥AtDFR(Tair accession:AT5G42800)〇 [0074] S21、报告载体的构建
[0075]利用DNA提取试剂盒（Tiangen)提取哥伦比亚生态型拟南芥的基因组DNA，以提取 的基因组DNA为模板扩增AtDFR的启动子，引物为：
[0076] F:GAGATTGGCACCACCTTCGCCTC；
[0077] R:TTTTGTGGTTATATG ATAGATTGTGCT。
[0078] 将AtDFR的启动子连接至pMD 18-T(Takara)克隆载体，转化至DH5a中，在含氨苄青 霉素的LB培养基上挑取阳性克隆，进行测序。将测序正确的克隆提取质粒，Sac I和ΚρηΙ双 酶切。将双酶切后的AtDFR启动子克隆至报告载体pGreen II0800-LUC中，进行重组质粒的 酶切鉴定和测序鉴定，提取序列正确的重组质粒存放至_20°C备用。
[0079] S22、激活载体的构建
[0080] 克隆梨PyMYB10.2、拟南芥AtbHLH2和杨梅MrbHLHl的0RF序列，所用引物如下：
[0081]PyMYB10.2.F:SEQ ID N0:3,PyMYB10.2.R:SEQ ID N0:4；
[0084]将扩增PCR产物进行纯化、回收测序。挑选测序正确的克隆提取质粒，然后利用Sac I/ΚρηΙ双酶切将PyMYB10.2和AtbHLH2克隆至激活载体pGreen II62-SK中，利用EcoRI/ Hindlll双酶切将MrbHLHl克隆至pGreen II62-SK载体中，并对重组质粒进行酶切和测序鉴 定序列的正确性。最后通过利用电击转化方法将构建好的载体导入农杆菌GV3101中。在添 加25111〖/1^利福平（1^1^111卩;[0;[11)和2511^/1^庆大霉素（6611丨3111；[0;[11)以及5011^/1^卡那霉素 (Kanamycin)的YEP培养基上进行抗性筛选，通过PCR对抗性农杆菌进行鉴定。将转化成功的 农杆菌保存在_20°C或_80°C备用。
[0085] S23、转基因烟草的构建
[0086]农杆菌侵染的烟草材料为本式烟草，具体的侵染方法如下:烟草种植在温室中，温 室的条件为平均光强为100μ molπ^?Γ1，光照/黑暗的时数为16h/8h，温度为25°C。同时播种 且至少含有6片叶片的成熟烟草用于瞬时表达，选择幼嫩的叶片作为侵染对象。制备农杆菌 侵染夜，将含有构建好表达载体的GV3101单克隆挑至含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin)液 体YEP中，28°C过夜培养。取出部分农杆菌培养液与10mMMgCl2和0.5μΜ乙酰丁香酮混合，调 整0D至0.2,室温放置2h后即可进行侵染。含有报告载体的农杆菌与含有激活载体的农杆菌 菌液按体积比1:9的比例混合，取300yL的农杆菌混合液针注射到烟草幼叶上，每个叶片上 注射2~3个点。侵染后3d，利用双焚光素酶检测试剂盒(promega公司）测定萤火虫焚光素酶 (fireflyluciferase)和海肾焚光素酶(reni11aluciferase)的酶活性。方法为:取大小 为2cm左右的烟草叶片，放在500yL裂解液中研磨，取5yL的粗提液（稀释100倍）与40yL luciferaseassaybuffer混合，利用OrionMieroplateLuminomete(BerthoId NetectionSystem)测定焚光强度，然后再加40yLStopandGlowbuffer，测定焚光强度， Luc/Ren的比值作为衡量转录因子对AtDFR启动子调控能力的指标。以仅侵染AtDFR启动子 报告载体农杆菌的烟草作为对照，每个处理设置3个重复。试验结果表明PyMYBlO.2能够调 控AtDFR启动子活性，在花青苷调控相