关bHLH存在时，大大增强PyMYBlO. 2的调控功能，在所 有组合中，以PyMYBlO. 2-AtbHLH2的激活活性最大（统计结果如图2所示）。由此可见， PyMYBlO. 2和bHLH转录因子在调控花青苷结构基因的表达过程中存在协同效应。
[0087]侵染激活载体农杆菌的烟草温室培养8天后，观察注射区域颜色的变化并拍照。发 现PyMYBlO. 2-AtbHLH2注射区域有花青苷的积累最多（如图3所示）。
[0088] 实施例3
[0089]为进一步验证PyMYBlO. 2基因的花青苷调控功能，本发明在实施例3中进一步提供 了PyMYBlO. 2的转基因试验。具体来说是将PyMYBlO.2过量表达于拟南芥中，观察转基因拟 南芥表型的变化。
[0090]S31:PyMYB10.2过表达载体的构建
[0091]将5'含有BamHI，3'含有SacI酶切位点的？7]\^810.2连接至克隆载体？]\〇)18-丁(Takara)中，转化至大肠杆菌DH5a中，挑取阳性克隆测序。利用BamHI/SacI双酶切将 PyMYBlO.2的序列克隆至过量表达载体pBI121中，通过测序鉴定重组质粒的正确性。最后利 用电击转化方法将构建好的载体导入农杆菌GV3101中，在添加25mg/L利福平(Rifampicin) 和50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的YEP培养基上进行抗性筛选，通过PCR对抗性农杆菌进行 鉴定。最后分别将含有35s:PyMYBlO. 2表达载体和空载体存放至-20°C备用。
[0092] S32:对拟南芥进行农杆菌侵染转化：
[0093]侵染的拟南芥为哥伦比亚生态型，在温室内培养。培养条件为光强为120_150μπιο1πΓ2。，光照/黑暗的时数为16h/8h，温度为25°C。待拟南芥花序抽苔约lcm时，将主花序的顶 端剪掉，以诱导侧花序的生成。在侧花序生长至花蕾期时，进行农杆菌侵染。应在转化前一 天进行农杆菌的准备，含有35s:PyMYBlO. 2表达载体和空载体的农杆菌各取5ml，在添加 25mg/L利福平(Rifampicin)和50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的YEP培养液中进行活化，取1-3mL活化后的菌液加到200-600mL含抗生素的YEP培养液中过夜培养。农杆菌活化培养的温 度为28°C。第二天，室温下5000-6000rpm离心5-8min收集菌体，用侵染夜悬浮（5 %鹿糖+ 0.05%3丨1?扣1^-77)，最后将侵染夜的00值调整为0.8，？!1调整为5.8。将拟南芥的花序完全 浸到浸染液中，放入真空栗，抽真空lmin，缓慢放气，重复一次再抽30s，放气。然后将侵染后 的拟南芥放到箱子里，移至温室中，覆膜黑暗培养一天。第二天取出放到光下继续生长。根 据浸染过的植株的长势，隔5-7天再浸一次，可重复侵染3次。后几次浸染不必抽真空。一个 月后收种子，将种子放在4°C条件下保存。
[0094]S33、转基因拟南芥筛选鉴定
[0095]先将To代收获的种子进行消毒处理，消毒程序为75%酒精消毒2-3min，然后用 2.6%似(：10消毒1〇11^11，再用无菌水冲洗3-4次。将消毒后的拟南芥种子平铺至含10〇11^/1Kan抗生素的培养基上进行筛选。选择Kan筛选后生长良好的植株进行培养，提取DNA进行 PCR鉴定。将获得的To代阳性植株收种子，播种获得h代植株，提取DNA再次进行PCR鉴定，对 阳性植株进行表型观察。发现h阳性植株幼苗有红色、紫红色表型，意味着有大量花青苷的 积累。但是，生长状态不是很好，所以我们选取生长状态好的T1代阳性植株作为观察对象， 值得注意的是这些植物主要营养器官的表型未发现特别的变化，而未成熟种子有红色表型 的变化，表明有花青苷的积累。转化空载体的拟南芥未出现这样的现象，表明PyMYBlO. 2能 调控花青苷的合成。
[0096]综上所述，本申请根据已知花青苷调控R2R3-MYB转录因子保守区域设计兼并引 物，以"早红酥"梨叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。筛选与花青苷调控 R2R3-MYB转录因子同源性高的基因片段进行RACE-PCR扩增，获得cDNA全长。通过与拟南芥、 梨中的R2R3-MYB转录因子Blast比对分析，发现它与拟南芥AtMYB90、梨PyMYBlO和 PyMYB10.1具有很高的同源性。其中，与PyMYB10和PyMYB10.1的相似性分别为32.7 %和 43.4%，该基因被命名为PyMYBlO.2,其核苷酸序列为SEQIDNO: 1所示，其编码的氨基酸序 列为SEQID腸：2所示。？71〇^10.2含有1?21?3-1〇^结构域和《11^结合域，并与花青苷调控 R2R3-MYB转录因子聚为一类。利用双荧光素酶检测试验分析，发现PyMYBlO. 2可以激活花青 苷结构基因二氢黄酮醇还原酶基因（AtDFR)的表达，在花青苷调控相关bHLH转录因子存在 时，大幅增强PyMYBlO· 2的调控能力。
[0097] 利用酶切、连接技术将PyMYBlO. 2连入含有CaMV35S强启动子的表达载体中。在烟 草或拟南芥中过量表达PyMYBlO.2基因，发现超表达PyMYBlO.2基因的材料积累大量的花青 苷。说明PyMYBlO. 2具有花青苷调控功能。
[0098]尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
【主权项】
1. 一种花青苷调控基因PyMYBlO.2，其特征在于，所述调控基因的核苷酸序列如SEQID NO: 1所示。2. 权利要求1所述的花青苷调控基因PyMYBlO. 2编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的 氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3. 含有权利要求1所述基因的重组质粒。4. 如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒为pMD18-T、pBI121、pGreen II62-SK。5. 含有权利要求3或4所述重组质粒的宿主细胞。6. 权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌和农杆菌 GV3101〇7. -种将权利要求1中所述基因转入烟草中的转基因方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 、提取梨总基因组DNA作为模板，以SEQIDN0:3、SEQIDN0:4所示核苷酸序列的引 物进行扩增； 2) 、将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO: 1的基因片段定向克隆到 pGreenII62-SK上，得到重组质粒； 3) 、将所述重组质粒转化至农杆菌GV3101后用所述农杆菌GV3101对烟草进行侵染转 化，得到转基因烟草。8. -种将权利要求1中所述基因转入拟南芥中的转基因方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 、提取梨总基因组DNA作为模板，以SEQIDN0:3、SEQIDN0:4所示核苷酸序列的引 物进行扩增； 2) 、将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO: 1的基因片段定向克隆到 PBI121上，得到重组质粒； 3) 、将所述重组质粒转化至农杆菌GV3101中，随后用所述农杆菌GV3101对拟南芥进行 侵染转化，得到转基因拟南芥。9. 如权利要求8所述的转基因方法，其特征在于，步骤2)具体包括： 将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO: 1的基因片段定向克隆到PMD18-T克隆载体中，对所述克隆载体进行扩增;将PyMYBlO. 2基因片段从克隆载体上酶切 下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的表达载体PBI121上，得到重组质粒。10. 权利要求1所述的基因在调控植物花青苷合成中的应用。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种植物花青苷调控基因PyMYB10.2，以及其在调控植物花青苷合成中的应用。本发明所提供的花青苷调控基因来源于梨，具体品种为“早红酥”，克隆到的基因命名为PyMYB10.2。本发明包括(1)克隆一个花青苷调控基因PyMYB10.2；(2)提供该基因及其编码蛋白的序列；(3)提供将该基因转入烟草或拟南芥中的转基因方法；(4)提供该基因在调控植物花青苷合成中的应用。通过对PyMYB10.2的研究，可对该类基因进行挖掘，研究其花青苷调控机理，有利于了解梨花青苷合成调控的分子基础。同时，本申请提供的应用在关于花青苷的科研和农业研究中具有深入挖掘的前景。
【IPC分类】C07K14/415, A01H5/00, C12N15/82, C12N15/29, C12N15/70, C12R1/19, C12N1/21
【公开号】CN105420248
【申请号】CN201610024864
【发明人】冯守千, 孙莎莎, 陈学森
【申请人】山东农业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2016年1月14日