237A>C突变的上游探针序列）
[0090] 5,CTGCAAACAGTGCAGATGGATAAACAT3，
[0091] 序列8 (检测MTM1基因c. 1237A>C突变的下游探针序列）
[0092] 5'CGTGAGTCAGTAGGGAGTTATAAGATA3'
[0093] 序列11 (检测MTM1基因c. 231+2T>C突变的上游探针序列）
[0094] 5,GCAAAGAACCACTGTTCTACACCTAAC3，
[0095] 序列12 (检测MTM1基因c. 231+2T>C突变的下游探针序列）
[0096] 5'AGATACCAAGATACACAACAAATGGCA3'
[0097] 检测MECP2基因突变的探针序列为序列13和14 :
[0098] 序列13 (检测MECP2基因突变的上游探针序列）
[0099] 5'GGTATGCTTTTGTAGTGTCGAAGTGTC3'
[0100] 序列14(检测MECP2基因突变的上游探针序列）
[0101] 5'GTATATGTCCTGGTTTGGCCATCTGTT3'
[0102] 检测MUT基因突变的探针序列为序列15和16 :
[0103] 序列15 (检测MUT基因突变的上游探针序列）
[0104] 5,ACACATAGAGGCATTTAGAAAATGGGC3，
[0105] 序列16 (检测MUT基因突变的上游探针序列）
[0106] 5'AGTTATGATCAAAGAAGAGAGTAAAGCT3'
[0107] 检测MPZ基因突变的探针序列为序列17和18 :
[0108] 序列17 (检测MPZ基因突变的上游探针序列）
[0109] 5'TGGGGGACTTGACAGCAGGCCGGA3'
[0110] 序列18 (检测MPZ基因突变的上游探针序列）
[0111] 5 'GCTTCGACGCGTCCTTTCCTGGCTTGT3 '
[0112] 检测PMP22基因突变的探针序列为序列19和20 :
[0113] 序列19 (检测PMP22基因突变的上游探针序列）
[0114] 5'GAGAGCAAGTTGTTTTCCTTGTTCCCA3'
[0115] 序列20 (检测PMP22基因突变的下游探针序列）
[0116] 5 'ATAGGGAAGGGAGGAAGGGAAAACAGA3 '
[0117] 米用illuminaTruSeqCustomAmpliconKit试剂对71例临床样本和17例正常 对照样本进行文库制备和合并。合并后的文库采用MiSeq测序仪进行测序，读长2X300bp。 下述方法中的步骤（C)、（d)、（e)、（f)、（g)和（h)所用试剂均是illumina公司生产的TruSeqCustomAmpliconKit试剂。
[0118] (a)基因组DNA的提取
[0119] 提取各外周血样本的基因组DNA，提取方法可参照《分子克隆实验指南》中提供的 基因组DNA提取方法，也可购买商品化试剂盒（如QIAGEN公司）按照说明书操作。
[0120] (b)基因组DNA的质控
[0121] 对提取的基因组DNA进行质控，Nanodrop2000分光光度计测纯度，要求0D26Q/0D2S。 在1. 8~2. 0之间；Qubit焚光光度计测定浓度，要求浓度不低于3. 5ng/μL，总量不低于 50ng〇
[0122] (c)探针与基因组DNA杂交
[0123] 将成套探针和杂交缓冲液依次加到稀释后的基因组DNA中，95°C孵育lmin，然后 缓慢降温到40°C，得到杂交混合液。
[0124] (d)杂交产物的纯化
[0125] 组装过滤板，用缓冲液预洗过滤板孔。将杂交混合液加入到过滤膜中，离心，过滤 掉没有与基因组DNA结合的探针，然后用洗涤buffer进行洗涤，离心，得到探针-基因组 DNA杂交复合物。
[0126] (e)探针的延伸-连接
[0127] 向纯化后的探针-基因组DNA杂交复合物中，加入延伸-连接酶和buffer混合液， 37°C孵育 45min。
[0128] (f)延伸-连接产物的纯化
[0129] 孵育结束后，将得到的延伸-连接产
[0130] 物采用AMPure XP磁珠（美国Beckman公司）进行纯化，去除未反应完的酶、 buffer和dNTP Mixture。
[0131] (g)PCR扩增
[0132] 取96孔PCR板，将i5接头管按PCR板A-Η的方向排列，将i7接头管按PCR板1-12 的方向排列，向PCR板的每行（1-12)加入相同的i5接头，向PCR板每列（A-Η)加入相同的 i7接头；向PCR板孔中加入PCRmastermix;再向每个孔中加入纯化后的延伸-连接产物。 短暂离心，进行PCR扩增，扩增条件：95°C预变性3min;95°C变性30s，66°C退火30s，72°C延 伸60s共扩增25~30个循环；最后72°C延伸5min。
[0133](h) PCR扩增产物的纯化
[0134] 扩增后得到的PCR产物，使用AMPure XP磁珠（美国Beckman公司）进行纯化，并 按照产品推荐的方案进行实验操作。
[0135] ⑴文库的质控
[0136] 纯化后的PCR产物进行浓度检测和扩增片段大小检测。使用Qubit荧光光度计用 BR试剂粗略测定浓度，使用QPCR仪准确测定浓度。用Agilent2100生物分析仪检测文库 大小分布，上样量luL，文库大小分布要求：单峰、片段大小在600bp左右。
[0137] (j)文库的合并
[0138] 对质控合格的文库进行合并，根据每个文库的浓度计算每个文库合并时加入的体 积，等摩尔合并各个文库；根据测序仪的数据通量、目标区域大小和需要的覆盖深度，计算 合并的文库个数。
[0139] (k)文库的稀释和上机测序
[0140] 用杂交稀释buffer(illumina公司产品，货号：为MS-102-3003)稀释合并后的文 库，然后按照测序仪的操作说明进行簇生成和测序。
[0141] 3.数据分析采用MiSeq测序仪配套的数据分析软件MiSeq Reporter进行原始数 据的处理、分析，检测SNP和Indel变异。
[0142] 对检测的SNP和Indel变异使用snpEff软件进行注释。尤其关注无义突变 (nonsensevariant)、移码突变（frameshift)、选择性剪切变异（Splicingvariant)、 错义突变（missensevariant)、氨基酸截断或插入变异（nonframeshift)和密码子丢失 (stoplost)六种变异类型。
[0143] 利用ClinVar等疾病数据库和其他突变数据库筛选出已知的致病突变，利用人群 数据库，如dbSNP数据、千人基因组数据库、ESP(外显子组测序数据库）过滤掉已知变异。 同时利用正常对照样本的测序结果对剩下的变异进行过滤。选取患者中存在的变异，而正 常对照样本中不存在的变异。
[0144] 利用SIFT、Polyphen、MutationTaster等多款预测软件对SNP进行功能预测。预测 结果为致病SNP为潜在的致病突变。在这些突变中发现MPZ基因发生了c.602delA的杂合 突变，MTM1基因发生了c. 1237A>C的纯合突变和c. 231+2T>C的纯合突变。使用Sanger测 序证实了该突变的存在，且在17例正常对照样本中证实该突变不存在。利用UCSC数据库的 100个脊椎动物的比较基因组分析发现MPZ基因的c. 602delA突变，MTM1基因的c. 1237A>C 突变和MTM1基因的c. 231+2T>C突变位于高度保守位点。
[0145] 4.实验结果
[0146] 通过110个致病基因的靶向重测序及生物信息分析发现三名患者各自发生了一 个位点的突变，分别是MPZ基因上c. 602delA的杂合突变，MTM1基因上c. 1237A>C的纯合 突变和MTM1基因上c. 231+2T>C的纯合突变。0M頂数据库注释MPZ基因和MTM1基因对应 的疾病如表1。
[0147] 表1、0M頂数据库注释MPZ基因和MTM1基因对应的疾病
[0148]
[0150] 通过家系内共分离实验及患者的临床表现与基因突变相关疾病的表型信息证明， MPZ基因上c. 602delA的杂合突变与进行性神经性腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease，CMT)有关；MTM1基因上c. 1237A>C的纯合突变和MTM1基因上c. 231+2T>C的纯合 突变与X连锁的肌小管性肌病（Myotubularmyopathy,X-linked)有关。
[0151] 野生型MPZ基因cDNA编码区序列，加粗字体表示突变型缺失位点：
[0153] 野生型MPZ基因编码的蛋白质氨基酸序列，加粗字体表示突变型移码突变起始位
[0154] 突变型MPZ基因cDNA编码区序列（序列表中序列21)，" □"表示缺失位点：
[0156] 突变型MPZ基因编码的蛋白质（该蛋白质为MPZ发生p. Lys201AsnfsTer51突变 得到的蛋白质，该蛋白质由序列21所示的DNA分子编码）氨基酸序列（序列表中序列22)， 其中加粗字体表示与野生型MPZ相同的序列：
[0157]
[0158] 野生型MTM1基因cDNA编码区序列，□表示c. 1237A>C突变位点：
[0160] 野生型MTM1基因编码的蛋白质氨基酸序列，□表示p.Ser413Arg突变位点：
[0162]c. 1237A>C突变型MTM1基因cDNA编码区序列（序列表中序列23)，" □"表示突 变位点：
[0164]c. 1237A>C突变型MTM1基因编码的蛋白质氨基酸序列（序列表中序列24)，" □" 表示突变位点：
[0166]野生型MTM1基因（c. 231+2T>C)位点上下游序列，□表示突变位点：
[0168]突变型MTM1基因（c. 231+2T>C)突变位点上下游序列（第四个内含子部分序列为 序列表中序列25)，" □"表示突变位点：
[0170] 5.变异的质量控制步骤和条件
[0171] 每个样本检测出的变异数目有几百个，按照MiSeqR印orter软件默认的质量控制 条件，通过质量控制的变异经Sanger测序法验证的一致率为61. 42%，没有通过质量控制 的变异经Sanger测序法验证的一致率为17. 78%。由此可见按照默认的质量控制条件会有 较高的假阳性和假阴性。为降低假阳性和假阴性，建立了一套基于MiSeq扩增子测序的变 异质量控制步骤和条件：
[0172] (a)过滤掉标记为"R8"的变异；
[0173] (b)过滤掉标记为"LowVariantFrequency" 的变异；
[0174] (c)过滤掉标记为"Low GQX"的变异；
[0175] (d)过滤掉QUAL值小于50的变异；
[0176] (e)基因型杂合时，过滤掉测序深度小于20乘的变异；基因型为纯合时，过滤掉测 序深度小于4乘的SNP和测序深度小于10乘的Indel。
[0177] 按照上述质量控制步骤和条件，通过质量控制的变异经Sanger测序法验证一致 率为89. 28%，没有通过质量控制的变