一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 水不溶性葡聚糖（Insoluble glucan，IG)是一类不溶于水溶液、以葡萄糖为单一 组分聚合而成的一种糖类多聚物，这类理化性质特殊的碳水化合物不但来源广泛，在植物、 真菌以及细菌的代谢产物中均有报道，而且种类繁多。目前报道较多的IG有dextran、 curdlan和cellulose三种，从结构特点来看，已报道的这些IG的分支仅由α-(1，2)、α-(1，3) 或α_(1，4)糖苷键中的一种将支链与主链连接起来，极少涉及2种或以上糖苷键的分支结 构。因此，新构型IG的筛选与发现不仅为IG家族增添了新的成员，而且极大地推动了IG结构 有关研究的前沿领域。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是当前水不溶性多糖来源狭隘，支链与主链的连接结 构糖苷键类型单一，制备方法繁琐，用于制备的菌种为有害菌等问题，本发明提供了一种肠 膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其制备方法。
[0004] 本发明人发现保藏号为CGMCC No. 10064的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)BD3749在合成培养基中培养后得到的发酵液制备可得具有特殊结构的水 不溶性胞外多糖，由此发明人完成了本发明。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为:一种肠膜明串珠菌的水不 溶性胞外多糖，所述的水不溶性胞外多糖为一种主链由α_(1，6)糖苷键连接而成，支链由α-(1，3)和€ 1-(1，4)糖苷键连接而成的葡聚糖，其中，糖苷键€[-(1，6):€[-(1，3):€ [-(1，4)的摩尔 比例为 1:0.2~0.3:0.3~0.4。
[0006] 所述水不溶性胞外多糖为一种同时拥有α-(1，3)和α-(1，4)糖苷键的水不溶性葡 聚糖，较佳地呈白色粉末状。
[0007] 所述的水不溶性胞外多糖较佳地由保藏编号为CGMCC No. 10064的肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)BD3749产生。
[0008] 如前所述肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖可以由下述制备方法制备而得。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为:一种肠膜明串珠菌的水不 溶性胞外多糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0010] 1)将肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesentero ides) BD3749接种于培养基中，发酵 培养获得发酵液；
[0011] 2)将步骤1)所得发酵液冷冻干燥后，取冻干粉末用碱液浸提，取上清，调节pH至7， 取沉淀，冷冻干燥即得。
[0012] 本发明步骤1)为：将肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)BD3749接种于 培养基中，发酵培养获得发酵液。
[0013] 本发明制备方法中所述的肠膜明串珠菌BD3749已于2014年11月26日保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，邮编：100101。该菌株的建议的分类命名为 ：肠膜明串珠菌1^11(：〇11〇^〇(3 mesenteroides，该菌株的保藏编号为:CGMCC如.10064，所保藏的培养物名称为403749。 [0014]本发明所述肠膜明串珠菌BD3749的制备方法为常规的，较佳地还包括该肠膜明串 珠菌BD3749活化获得肠膜明串珠菌种子的步骤。所述肠膜明串珠菌种子为常规方法获得， 较佳地为包括以下步骤的方法:将肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)BD374^9 冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含5%蔗糖的M17固体培养基(购买 自0X0ID，英国），30°C好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL含5%蔗糖的M17液 体培养基（购买自0X0ID，英国），运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30°C， 180rpm振荡培养24h取出，以2%(v/v)接种量接种于含5%蔗糖的M17液体培养基(购买自 0X0ID，英国），30°C，180rpm振荡培养24h后，将培养物15，OOOrpm离心10分钟，弃去上清，菌 体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子(亦称肠 膜明串珠菌种子液）。所述肠膜明串珠菌BD3749的冻干粉由以下方法制备:挑取2个菌落，接 种于300mL的10 % (w/w)的脱脂乳溶液里30°C培养4h，-80°C预冻过夜，_20°C冷冻干燥。
[0015] 其中，所述的培养基为本领域常规的培养基，只要能培养肠膜明串珠菌即可，较佳 地为合成培养基，所述合成培养基包括以下组分：蛋白胨1 %、酵母提取物0.5%、 K2HP〇4〇 · 5%、CaCl20 · 034%和蔗糖5~30%，蔗糖的含量较佳地为10~20%，更佳地为10%， 余量为水，所述百分比为质量百分比。所述合成培养基的制备方法为本领域常规的制备方 法。所述培养基的pH较佳地为5~8，更佳地为7。
[0016] 其中，所述的发酵培养为本领域常规培养方法，所述肠膜明串珠菌的接种量较佳 地为1~5%，更佳地为2~4%，最佳地为3%，所述百分比为体积百分比。所述的发酵培养较 佳地为振荡培养，所述振荡培养为常规的，振荡速度较佳地为100~300rpm，更佳地为150~ 250rpm，最佳地为200rpm。所述的发酵培养的发酵温度较佳地为15~37°C，更佳地为25°C~ 33°C，最佳地为30°C，发酵时间较佳地为24~96小时，更佳地为48~84小时，最佳地为72小 时。
[0017] 本发明步骤2)为:将步骤1)所得发酵液冷冻干燥后，取冻干粉末用碱液浸提，取上 清，调节pH至7,取沉淀，冷冻干燥即得。其中，所述冷冻干燥为本领域常规的冻干（即冷冻干 燥)技术，只要达到去除水分，获得固形物的目的即可。所述碱液为常规的，较佳地为NaOH溶 液，所述NaOH溶液的浓度为1~5M，较佳地为2~4M，更佳地为3M。所述浸提为常规的，所述浸 提时冻干粉末与碱液的比例为1 g: lmL~1 g: 5mL，较佳地为1 g: 2mL~1 g: 4mL，更佳地为1 g: 3mL。所述上清为常规方法取得，较佳地为离心，所述离心为常规的，离心的速度较佳地为8， 000~15,000g，更佳地为10,000~12,00(^，离心的时间较佳地为5~15分钟，更佳地为8~ 12分钟。所述pH使用常规方法调节，较佳地为用酸液调节，所述酸液为常规的，较佳地为HC1 溶液，所述HC1溶液浓度为1~3M，较佳地为1.5~2.5M，更佳地为2M。
[0018] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0019] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0020] 本发明的积极进步效果在于：
[0021] 1、本发明解决了当前水不溶性多糖(尤其是水不溶性葡聚糖)来源狭隘的现状，为 水不溶性多糖的来源提供了另一种的选择。
[0022] 2、采用本发明制备的水不溶性胞外多糖具有罕见的两种支链糖苷键并存的形态， 是一种结构新颖的多糖，根据结构越复杂的多糖功能也相对较多的理论，因此，具有一定的 开发意义。
[0023] 3、常规多糖的制备步骤中往往涉及了去蛋白的步骤(如SAVAGE法去蛋白），但本发 明制备方法中发酵液不调节pH直接冷冻干燥，酸性发酵液被逐步冻干失水时，pH不断下降， 造成局部过酸，导致发酵液中的游离蛋白迅速变性，这部分蛋白在碱液浸提时被离心除去， 从而达到了去蛋白的目的。
[0024] 4、肠膜明串珠菌属于乳酸菌范畴，所以与其他来源菌株(如芽孢菌、产气菌、霉菌 等)产生的不溶性多糖相比，来自肠膜明串珠菌的胞外多糖具有更高的食品安全性。本发明 制备所得的胞外多糖提取物可以作为功能性添加剂替代其他来源的水不溶性多糖应用于 食品、制药和相关领域中，其应用前景十分广阔。
[0025] 生物材料保藏信息
[0026]本发明的肠膜明串珠菌BD3749，已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为:CGMCC No. 10064,培养物名称是BD3749,分类 命名是肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides〇
【附图说明】
[0027]图1显示肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖的单糖组成测定结果。
[0028]图2显示肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖