一种羧甲基化龙眼肉多糖及其在制药中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种羧甲基化龙眼肉多糖及其在制药中的应用。
【背景技术】
[0002] 分子修饰是运用物理、化学、生物等方法对化合物分子进行结构改造，以获得不同 结构类型衍生物的方法。对多糖进行分子修饰，可以使多糖的相对分子质量、黏度、水溶解 度、电荷数、空间构象等发生改变，增强天然多糖的生物活性甚至使多糖产生新的活性，还 可降低多糖类药物的毒副作用，从而有利于多糖类药物的开发与应用。羧甲基化修饰是向 多糖链上引入羧甲基，羧甲基化多糖可提高多糖的溶解性和电负性，并对其抗肿瘤活性有 很大的提高，且能增强甚至产生新的生物活性。例如，黑木耳多糖经适当羧甲基化修饰后可 使其抗氧化活性提高将近一倍;对虎奶多糖进行羧甲基化修饰，得到一种水溶性良好的羧 甲基化虎奶多糖，它能有效抑制Fe 2+-Vc引起的大鼠肝线粒体脂质过氧化、膜流动性的降低 和线粒体的肿胀;孔石莼多糖经羧甲基化修饰后，其降血脂作用得到显著增强;将黄芪多糖 进行羧甲基化改性后，其促生长和增强免疫活性均非常明显。因此，非常有必要对龙眼肉多 糖进行羧甲基化修饰，为探索结构修饰对龙眼肉多糖生物活性的影响，通过分子修饰技术 提高和开发龙眼肉多糖的生物功效奠定基础。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供羧甲基化龙眼肉多糖的合成方法，并获得羧甲基化龙眼肉多 糖抗氧化作用和体内调节免疫作用的结果。
[0004] 本发明通过以下技术方案达到上述目的：
[0005] -种羧甲基化龙眼肉多糖，由以下方法合成:将龙眼肉多糖溶于氢氧化钠溶液中， 加入一氯乙酸的同时搅拌反应，再将反应液进行透析浓缩、醇沉和冷冻干燥后得到羧甲基 化龙眼肉多糖。
[0006] 所述的羧甲基化龙眼肉多糖的合成方法具体为:将龙眼肉多糖溶于3mol/L氢氧化 钠溶液中，剧烈搅拌下缓慢加入一氯乙酸，使其终浓度为1.2mol/L;混匀后在73°C下继续搅 拌反应3.2h后，冷却，用HC1溶液调节pH值至中性;将反应液置于截留分子量为3500的透析 袋中透析48h，透析液经浓缩，醇沉和冷冻干燥后得到羧甲基化龙眼肉多糖。
[0007] 本发明还要求保护所述的羧甲基化龙眼肉多糖在制药中的应用。
[0008] 进一步地，羧甲基化龙眼肉多糖在制备药物中的应用包括以下7个方面：
[0009] (1)羧甲基化龙眼肉多糖在制备抗氧化或免疫调节药物中的应用。
[0010] (2)羧甲基化龙眼肉多糖在制备清除自由基药物中的应用，羧甲基化龙眼肉多糖 有效浓度为2~12mg/ml。
[0011] (3)羧甲基化龙眼肉多糖在制备抗脂质过氧化药物的应用，羧甲基化龙眼肉多糖 有效浓度为〇 · 25~4 · 00g/L。
[0012] ⑷羧甲基化龙眼肉多糖在制备抑制红细胞溶血药物的应用，羧甲基化龙眼肉多 糖有效浓度为28.60~457. lμg/ml。
[0013] (5)羧甲基化龙眼肉多糖在制备提高T淋巴细胞免疫水平药物中的应用，羧甲基化 龙眼肉多糖有效浓度为20~160mg/kg。
[0014] (6)羧甲基化龙眼肉多糖在制备提高体液免疫功能药物中的应用，羧甲基化龙眼 肉多糖有效浓度为40~160mg/kg。
[0015] (7)羧甲基化龙眼肉多糖在制备增强非特异性免疫功能药物中的应用，羧甲基化 龙眼肉多糖有效浓度为20~160mg/kg。
[0016] 本发明的有益效果在于：
[0017] 将人工合成的羧甲基化龙眼肉多糖用于体外抗氧化和体内免疫活性实验，获得羧 甲基化龙眼肉多糖免疫调节作用及抗氧化作用的实验结果，为羧甲基化龙眼肉多糖在医药 领域的应用提供参考依据。
【附图说明】
[0018] 图1为实施例所述的龙眼肉多糖羧甲基化修饰前后红外光谱分析图，其中A线代表 龙眼肉多糖A，B线代表羧甲基化龙眼肉多糖A。
[0019] 图2为实施例所述的超氧阴离子自由基清除实验结果示意图。
[0020] 图3为实施例所述的龙眼肉多糖A和羧甲基化龙眼肉多糖A对小鼠脾脏指数的影响 结果示意图。（其中，n = 10/p〈0.05或#p〈0.01vS环磷酰胺组）
[0021] 图4为实施例所述的龙眼肉多糖A和羧甲基化龙眼肉多糖A对小鼠迟发型变态反应 的影响结果示意图。（其中，n = 10/p〈0.05或#p〈0.01vS环磷酰胺组）
[0022] 图5为实施例所述的龙眼肉多糖A和羧甲基化龙眼肉多糖A对小鼠血清中溶血素 (HC5Q)的影响结果示意图。（其中，n=10，*p〈0.05或、〈O.Olvs环磷酰胺组）
[0023] 图6为实施例所述的龙眼肉多糖A和羧甲基化龙眼肉多糖A对小鼠脾脏中LZM的影 响结果示意图。（其中，n = 10/p〈0.05或#p〈0.01vS环磷酰胺组）
[0024]图7为实施例所述的龙眼肉多糖A和羧甲基化龙眼肉多糖A对小鼠血清中LZM的影 响结果示意图。（n = 10，$〈0.05或#p〈0.01 vs环磷酰胺组）
【具体实施方式】
[0025]以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0026] 1、龙眼肉多糖A的制备
[0027]龙眼干果剥壳去核后，称取1.5kg龙眼肉于4倍量水中，控制水浴温度为90°C，每次 提取4h，提取次数3次。滤液浓缩后醇沉，干燥得龙眼肉粗多糖。龙眼肉粗多糖经脱蛋白、脱 色处理后得到龙眼肉精制多糖。DEAE-纤维素柱(2.5cmX80cm)分级纯化龙眼肉精制多糖， 依次用水，〇.125mol/L NaCl，0.30mol/L NaOH溶液进行洗脱，选取NaCl流分，用 36口1^〇巧13-300册柱(2.0〇111\40〇11)作进一步纯化，用水洗脱(48/滴），收集最大富集峰浓 缩后冷冻干燥，即得龙眼肉多糖A。
[0028] 2、龙眼肉多糖A羧甲基化修饰
[0029] 准确称取0.2000g龙眼肉多糖A样品，溶于10ml 3mol/L氢氧化钠溶液中，剧烈搅拌 下缓慢加入一氯乙酸，使其终浓度为1.2mol/L。混匀后在73°C下继续搅拌反应3.2h后，冷 却，用2.0mol/L的HC1调至中性。将反应液置于截留分子量为3500的透析袋中透析48h，透析 液经浓缩，醇沉和冷冻干燥后得到羧甲基化龙眼肉多糖A。
[0030] 3、龙眼肉多糖羧甲基化前后红外光谱分析
[0031]干燥的羧甲基化龙眼肉多糖A lmg与100mg KBr粉末于玛瑙研钵研磨均勾，压成薄 片，放入样品室，以龙眼肉多糖A为对照，于傅里叶红外变换光谱仪在4000~400CHT1范围内 进行扫描得到红外吸收光谱图。
[0032]由图1可知，3600-32000^1区域的吸收峰为糖的特征吸收峰，是由羟基0-H的伸缩 振动引起的，表明存在分子间和分子内氢键。3000-2800(31^1区域的吸收峰也为糖的特征吸 收峰，是由次甲基C-H的伸缩振动引起，表明有-CH 2基存在。谱图B在1603、1420、1326〇1^处 出现了C00-的特征吸收峰，其中，1603CHT 1处吸收峰为强峰，是C-0键非对称伸缩振动；在 1420、1326〇1^处两个峰为中强峰，分别为-CH-的变角振动和-C00的对称伸缩振动峰。证明 了龙眼肉多糖A确实已羧甲基化。羧甲基化后龙眼肉多糖A的其他特征吸收峰并无大的改 变，这是对羧甲基化修饰没有改变龙眼肉多糖A结构的佐证。
[0033] 4、羧甲基化龙眼肉多糖A相对分子量的测定
[0034]相对分子量的测定采用葡聚糖凝胶过滤法。SephadexG-100凝胶柱填装完毕后，平 衡24h，将蓝色葡聚糖2000配制3mg/ml的溶液，上样计算洗脱体积Vo，将葡聚糖标准品T-10、 T-40、T-70、T-500 (分子量分别为 lOKDa、40KDa、70KDa、500KDa)配制成浓度 3mg/ml 的溶液， 分