别上样，准确测定其洗脱体积。并以Ve/V〇和相对分子量的对数lgM作图，获得一条标准曲 线。将未知分子量的多糖样品在相同条件下层析，根据洗脱体积在标准曲线上求得其相对 分子质量。
[0035] 实验得出相对分子量标准方程为:y = -1.7448x+19.195，R2 = 0.9915。通过标准方 程计算出羧甲基化龙眼肉多糖A的相对分子量为:1.51 X 105Da。
[0036] 5、羧甲基化龙眼肉多糖A取代度的测定 [0037] 方法
[0038] (1)标准曲线的制备
[0039] 精密称取0.2500g羟基乙酸标准品，用水溶解后定容于100ml容量瓶，制成浓度为 2.50mg/ml的溶液。准确吸取标准品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0ml，分别置于25mL 具塞比色管中。蒸馏水补至lml。各加入铬变酸溶液5ml及浓H2S〇4lml，摇匀后于沸水浴上加 热30min。待比色管冷至室温，滴加30 %NH4Ac溶液至25ml刻线，振摇，溶液转变为紫红色。于 721型分光光度计上，在波长570nm处，以试剂空白为参比，测定各溶液的吸光度。以吸光度 值为横坐标，羟基乙酸质量浓度为纵坐标，绘制羟基乙酸质量浓度标准曲线。线性回归方程 为：c = 128.923A-1.044 R2 = 0.9955，在32.0~80.0μg/ml范围内，羟基乙酸质量浓度与吸 光度值线性良好。
[0040] (2)多糖样品羧甲基化取代度的测定
[0041] 精密称取0.1000g羧甲基化龙眼肉多糖，用适量蒸馏水溶解后定容于10ml容量瓶。 配成浓度为l〇mg/ml的溶液。准确吸取0.5ml多糖溶液，按5 (1)项中的方法，在波长570nm处 测定吸光值。根据工作曲线求出羧甲基化龙眼肉多糖A相当于羟基乙酸的质量，羧甲基化龙 眼肉多糖A的取代度计算方法为：
[0042] DS = 162B/[76-(59-l)B]
[0043]上式中，B为每克羧甲基化龙眼肉多糖A样品相当于羟基乙酸的质量。
[0044] 76-羟基乙酸摩尔质量(g/mol)
[0045] 59-CH2COOH 摩尔质量(g/mol)
[0046] 1-氢原子摩尔质量(g/mol)
[0047] 结果
[0048]经测定，羧甲基化龙眼肉多糖A的羧甲基取代度为1.053。
[0049] 6、龙眼肉多糖A和羧甲基化龙眼肉多糖A对超氧阴离子自由基清除能力的测定
[0050] 方法
[0051 ] 取50mmol/L pH为8.2的Tris-HCl缓冲液4.6ml于试管中，置25°C水浴预热20min 后，加不同浓度的供试液lml，10mmol/L邻苯三酸0.4ml，摇勾后25°C水浴4min，立即用8mol/ L HC1 0.1ml终止反应，以pH=8.2的Tris-HCl缓冲液调零点，并在325nm测定吸光度(Ax)， 模型对照组吸光度(A〇)用重蒸水lml代替供试液测定，样本对照组吸光度(A。）用重蒸水 0.4ml代替10mmol/L邻苯三酸测定。清除率E的计算方法如下：
[0052] E=[l-(Ax-Ac)/Ao]X100%
[0053] 结果
[0054]如图2所示，羧甲基化前后的龙眼肉多糖A均有清除超氧阴离子自由基的能力，且 呈现剂量依赖效应。当质量浓度相同时，羧甲基化后的龙眼肉多糖A的清除能力高于未修饰 的龙眼肉多糖A。质量浓度为12g/L时，羧甲基化龙眼肉多糖A清除率为62.9 %，比龙眼肉多 糖A提升了 29.4%。这是因为清除超氧阴离子的机理与0-H键的键能相关，羧甲基化龙眼肉 多糖A分子结构中存在较多的吸电子基团（如羟基、羧基），0-H键更容易断裂，能够提供更多 的质子用于中和超氧阴离子。
[0055] 7、龙眼肉多糖A和羧甲基化龙眼肉多糖A对小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响。
[0056] 方法
[0057]昆明种小鼠（25~30g，雌雄各半）禁食过夜后脱颈椎处死，迅速取出肝脏组织，置 冰冷生理盐水中洗净表面残血，以4°C生理盐水在冰片上制成10%小鼠肝组织匀浆，4°C 400〇1'/111；[11离心15111；[11，取上清液放上层冰箱备用。取10%肝勾衆1.01111于试管中，加入不同 浓度供试液1. 0ml混匀，于37°C水浴温孵1.5h后，加入10 %三氯乙酸2ml，0.67 %硫代巴比妥 酸2ml混勾，沸水浴中反应15min后取出，冷却至室温，4000r/min离心15min，取上清液，以生 理盐水调零点，并在532nm处测定吸光度(A x)。模型对照组(A0)用生理盐水lml代替供试液， 样本对照组(A。）用生理盐水lml代替10%肝匀浆。每个浓度组平行测定5份。测定结果以脂 质过氧化抑制率(I)表示，抑制率I和I C50 (达到50 %抑制率所需药物浓度)的计算方法如下：
[0058] I = [A0-(Ax-Ac)]/A〇X100%
[0059] 以I为纵坐标，多糖或维生素 C对数浓度为横坐标作图，建立回归方程，计算IC50。
[0060] 结果
[0061] 表1龙眼肉多糖A羧甲基化前后对小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响 (X ± 叉)
[0062]
[0063]本实验结果显示，龙眼肉多糖A和羧甲基化龙眼肉多糖A均可有效抑制小鼠肝组织 匀浆丙二醛(MDA)的产生，并呈一定的量效关系，显示出较好的抑制脂质过氧化活性。与龙 眼肉多糖A相比，羧甲基化龙眼肉多糖A抑制脂质过氧化效应更强，但两者抑制脂质过氧化 能力均不及维生素 C。
[0064] 8、龙眼肉多糖A和羧甲基龙眼肉多糖A对H202诱导的红细胞溶血的影响
[0065] 方法
[0066]昆明小鼠（20±2g)眼球采血1~2ml，加入到含有肝素钠的离心管中，1500r/min离 心lOmin，弃掉上清液得到红细胞沉淀，用冰冷生理盐水清洗3次，1500r/min离心5min，制成 0.5 % (V/V)的红细胞悬浮液。取lml红细胞悬液，加入不同浓度的供试液lml，再加入0.2ml 50mmol/L H2O2，在37°C下水浴温孵lh后，加5ml生理盐水稀释，3000r/min离心10min，取上清 液，以生理盐水为空白，在415nm波长处测定吸光度(A x)。模型对照组(A〇)用生理盐水lml代 替供试液，样本对照组(A。）用生理盐水lml代替0.5%红细胞悬浮液。每个浓度组平行测定5 份。测定结果以溶血抑制率(I)表示，I和IC 5Q的计算方法如下：
[0067] I = [A0-(Ax-Ac)]/A〇X100%
[0068] 以I为纵坐标，多糖或维生素 C对数浓度为横坐标作图，建立回归方程，计算IC50。
[0069] 结果
[0070] 表2龙眼肉多糖A駿甲基化如后对H2O2诱导的红细胞洛血的影响（x±s, ?=5_)
[0071]
[0072] 本实验结果显示，龙眼肉多糖A和羧甲基化龙眼肉多糖A对H202诱导红细胞溶血有 一定的抑制作用，且随着多糖浓度的增加抑制作用增强。龙眼肉多糖A和羧甲基化龙眼肉多 糖A的IC5Q分别为620.82和262.76μg/ml，后者抑制H202诱导红细胞溶血的能力更出色。
[0073] 9、环磷酰胺致免疫低下小鼠模型的建立
[0074]将小鼠适应性饲养24h后，按体重随机分组，每组10只，雌雄各半，除空白组腹腔注 射生理盐水外，环磷酰胺抑制组和其余各实验组小鼠每隔三天腹腔注射环磷酰胺一次， 20mg/kg，容量10ml/kg。实验组分为龙眼肉多糖A组(分为160mg/ml剂量组、80mg/kg剂量组、 40mg/kg剂量组和20mg/kg剂量组）、羧甲基化龙眼肉多糖A组(分为160mg/ml剂量组、80mg/ kg剂量组、40mg/kg剂量组和20mg/kg剂量组）以及香菇多糖组(40