一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制 备方法。
【背景技术】
[0002] 水不溶性葡聚糖（Insoluble glucan，IG)是一类不溶于水、以葡萄糖为单一组分 聚合而成的一种糖类多聚物，这类理化性质特殊的碳水化合物不但来源广泛，在植物、真菌 以及细菌的代谢产物中均有报道，而且种类繁多。目前报道较多的IG有dextran、curdlan和 cellulose三种，从结构特点来看，已报道的这些IG的分支仅由α-(1，2)、α-(1，3)或α-(1，4) 糖苷键中的一种将支链与主链连接起来，极少涉及2种或以上糖苷键的分支结构。因此，新 构型IG的筛选与发现不仅为IG家族增添了新的成员，而且极大地推动了IG结构有关研究的 前沿领域。
[0003] 此外，目前IG的获得都来自合成培养基，此类培养基成分多样，配方复杂，配制过 程繁琐具有潜在食品安全风险，再者，制备的成本相对较高、IG的来源相对有限，上述问题 很大程度上限制了 IG的开发和利用。
【发明内容】
[0004] 本发明为了解决目前水不溶性葡聚糖的制备使用的是成分多样，配方复杂的合成 培养基存在的成本较高，培养基配制繁琐，存在食品安全风险等问题，提供了一种肠膜明串 珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法。该制备方法所用番茄汁蔗糖培养基安全纯天然，配 制简单，原料来源广泛，成本低。
[0005] 本发明人发现保藏号为CGMCC No. 100064的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenter〇id es)BD3749在番茄汁蔗糖培养基中振荡培养后的发酵液经冷冻干燥，碱液浸 提，离心得到的上清液，再经酸液调节pH至7,离心取沉淀，冷冻干燥可获得具有特殊结构的 水不溶性胞外多糖，从而完成了本发明。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：一种肠膜明串珠菌的水不溶性 胞外多糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0007] 1)将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD3749接种于番前汁鹿糖培养 基中，发酵培养获得发酵液；
[0008] 2)将步骤1)所得发酵液冷冻干燥后，取粉末用碱液浸提，取上清，调节上清pH值至 7,取沉淀，冷冻干燥即得。
[0009] 本发明制备方法步骤1)为：将肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides) BD3749接种于番茄汁蔗糖培养基中，发酵培养获得发酵液。
[0010] 本发明步骤1)肠膜明串珠菌BD3749已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮 编：100101。该菌株的建议的分类命名为:肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，该菌 株的保藏编号为:CGMCC如.10064，所保藏的培养物名称为403749。
[0011] 其中，本发明所述肠膜明串珠菌BD3749的制备方法为常规的，较佳地还包括该肠 膜明串珠菌BD3749活化获得肠膜明串珠菌种子的步骤。所述肠膜明串珠菌种子为常规方法 获得，较佳地为包括以下步骤的方法:将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(所 述肠膜明串珠菌的保藏编号为CGMCC No. 10064)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种 环取一环划线于含5%蔗糖的M17固体培养基(购买自0X0ID Co.，英国），30°C好氧培养48h 取出，用接种环挑取单菌落放入10mL含5%蔗糖的M17液体培养基（购买自0X0ID Co.，英 国），运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30°C，180rpm振荡培养24h取出，以 2%(v/v)接种量接种于含5%蔗糖的M17液体培养基（购买自0X0ID Co.，英国），30°C， 180rpm振荡培养24h后，将培养物15，OOOrpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤 2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。所述肠膜明串珠菌BD3749的 冻干粉由以下方法制备:挑取2个菌落，接种于300mL的10%(w/w)的脱脂乳溶液里30°C培养 4h，-80°C预冻过夜，_20°C冷冻干燥。
[0012] 本发明步骤1)所述的番茄汁蔗糖培养基配制方法为本领域常规，较佳地由包括以 下步骤的方法制备:番茄榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清液，加入蔗糖加热溶解 后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。其中，所述过滤的方法为常规的，较佳地为利用80~ 120目纱布过滤取汁;所述煮沸的时间为常规的，较佳地为1~10分钟(min)，更佳地为3~8 分钟，最佳地为5分钟;所述离心为常规的，离心的速度较佳地为4，000~12，000g，更佳地为 6，000~10，000g，最佳地为8，000g，离心的时间较佳地为8~12分钟，更佳地为9~11分钟， 最佳地为10分钟;所述蔗糖的加入量较佳地为5~30%，更佳地为10~20%，最佳地为10% ; 所述灭菌为常规的，灭菌的温度较佳地为110~135°C，更佳地为115~125°C，最佳地为121 °C，灭菌的时间较佳地为10~30分钟，更佳地为15~25分钟，最佳地为20分钟;所述pH值的 调节方法为本领域常规的调节方法，较佳地为加入食品级碱调节pH值，所述食品级碱为本 领域常规，较佳地是:Na 2C03、NaHC03和NaOH中的一种或多种;所述pH值为常规的，较佳地为5 ~8，更佳地为6~7，最佳地为7。
[0013] 本发明步骤1)所述的发酵培养为常规的，所述发酵菌种的接种量较佳地为1%~ 5%，更佳地为2%~4%，最佳地为3%，所述百分比为体积百分比。所述的发酵培养较佳地 为振荡发酵培养，所述振荡的速度较佳地为100~300rpm，更佳地为150~250rpm，最佳地为 200rpm;发酵培养的温度较佳地为15°C~37°C，更佳地为25~33°C，最佳地为30°C;发酵培 养的时间较佳地为24~96小时(h)，更佳地为48~84小时，最佳地为72小时。
[0014] 本发明制备方法步骤2)为:将步骤1)所得发酵液冷冻干燥后，取粉末用碱液浸提， 取上清，调节上清pH值至7，取沉淀，冷冻干燥即得。
[0015] 本发明步骤2)所述冷冻干燥为本领域常规的冻干技术，只要达到去除水分，获得 固形物的目的即可。所述碱液为常规的，较佳地为NaOH溶液，所述NaOH溶液的浓度为1~5M， 较佳地为2~4M，更佳地为3M。所述浸提为常规的，所述浸提时冻干粉末与碱液的比例为lg: lmL~1 g: 5mL，较佳地为1 g: 2mL~1 g: 4mL，更佳地为1 g: 3mL。所述上清为常规方法取得，较佳 地为离心，所述离心为常规的，离心的速度较佳地为8,000~15,000g，更佳地为10,000~ 12，000g，离心的时间较佳地为5~15分钟，更佳地为8~12分钟。所述pH使用的常规方法调 节，较佳地为用酸液调节，所述酸液为常规的，较佳地为HC1溶液，所述HC1溶液浓度为1~ 3M，较佳地为1.5~2.5M，更佳地为2M。所述沉淀的取得为常规方法，较佳地为离心，离心条 件优选方案同离心取得所述上清的优选方案。
[0016] 由上述制备方法得到的肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖为一种同时拥有α-(1， 3)和α-(1，4)糖苷键的水不溶性葡聚糖，呈白色粉末状。
[0017] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0018] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0019] 本发明的积极进步效果在于：
[0020] 1、本发明解决了当前水不溶性多糖(尤其是水不溶性葡聚糖)来源狭隘的现状，为 水不溶性多糖的来源提供了另一种的选择；
[0021] 2、采用本发明制备的水不溶性多糖具有罕见的两种支链连接键并存的形态，是一 种结构新颖的多糖，根据结构越复杂的多糖功能也相对较多的理论，因此，具有一定的开发 意义。
[0022] 3、常规多糖的制备步骤中往往涉及了去蛋白的步骤(如SAVAGE法去蛋白），但本发 明制备方法中发酵液不调节pH直接冷冻干燥，酸性发酵液被逐步冻干失水时，pH不断下降， 造成局部过酸，导致发酵液中的游离蛋白迅速变性，这部分蛋白在碱液浸提时被离心除去， 从而达到了去蛋白的目的。
[0023] 4、肠膜明串珠菌属于乳酸菌范畴，所以与其他来源菌株产生的不溶性多糖相比， 肠膜明串珠菌的多糖具有更高的食品安全性。本发明制备所得的胞外多糖可以作为功能性 添加剂替代其他来源的水不溶性多糖应用于食品、制药和相关领域中，其应用前景十分广 阔。
[0024] 5、目前IG的制备都依赖于合成培养基，而运用番茄汁蔗糖培养基制备IG的研究尚 未报道过，本发明首次将番茄汁蔗糖培养基作为一种天然的发酵培养基应用于IG的制备， 因而其产物具有更高的食品安全性。
[0025] 6、本发明所述用于制备IG的主要原料为番茄，其来源广、成本低，发酵菌种为肠膜 明串珠菌单一菌种，上述组合有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制