4moL/L TFA(三氣乙酸，购自Sigma-Aldrich Co.LLC，美 国）充分混合，充N2封管，110°C烘箱中水解20h;冷却后打开盖，加200yL甲醇后用犯吹干，如 此重复加甲醇并用犯吹3次，去除TFA，将其残渣用水溶解定容至5mL，用0.45μπι微孔膜过滤 后供进样分析。
[0077] (2)色谱条件
[0078] 色谱柱：CarboPac PA203mm i .d. X 150mm；
[0079] 流动相：A，H2〇;B，250mmo 1/L NaOH;C，lmol/L CH3C00Na;
[0080] 三元梯度洗脱:流速:0.5mL/min;积分脉冲安培检测器；
[0081 ] Au工作电极:Ag/AgCl参比电极，
[0082] 进样体积:20yL;柱温:30°C。
[0083] 肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖A的糖基组成的色谱分析结果见图1，该多 糖在5.875min有单一吸收峰，且该吸收峰的保留时间与葡萄糖标品保留时间一致。
[0084]结论:肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖是由葡萄糖单一糖基组成，是一种 葡聚糖。
[0085]实施例7肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的结构判定 [0086] (1)傅里叶红外光谱(FTIR)测定
[0087]将上述方法制备的水不溶性胞外多糖A与溴化钾粉末充分混合后，压制成片状，应 用傅里叶红外光谱仪(Nicolet 6700，Thermo Fisher公司，美国）进行傅里叶红外光谱 (FTIR)测定。
[0088] 结果如图2所示，919CHT1处的吸收峰证明该多糖的碳骨架由α-糖苷组成，1004CHT1 处的吸收峰表明该多糖中存在大量α_(1，6)糖苷键，1102CHT1处为葡萄糖残基中C 一 0键振动 的吸收峰，1147CHT1处的吸收峰是糖苷键桥上C一0 - C的伸缩振动的结果。3281CHT1处的强 宽峰为分子间及分子内羟基吸收峰，2922CHT1为C 一 Η键伸缩振动的吸收峰，1645CHT1处的吸 收峰是结合水所致。
[0089] 结论:BD3749水不溶性胞外多糖主要以α-(1，6)糖苷键构成。
[0090] (2)核磁共振(NMR)测定
[0091]将上述方法制备的水不溶性胞外多糖Α按5mg/mL的浓度完全溶解于1Μ氖代氢氧化 钠溶液中，并应用核磁共振波谱仪(Avance III 400MHz，Bruker公司，德国）进行核磁共振 (NMR)测定。
[0092] 图3中，A为匪R-1!!谱，显示样品的7个质子的化学位移分别为4.945(H-1)，3.970 (Η-6)，3·887(Η-5)，3·787(Η-6'），3·705(Η-3)，3·554(Η-2)，3.477(H-4)pm，5.223和 5.315ppm处的吸收峰分别为糖苷键振动的结果，图3中，Β为NMR- 13C谱，显示样品在101.252 (C-l)，77.245(C-3)，74.843(02)，73 · 449(05)，72.850(04)和68.554(C-6)ppm处有共 振。
[0093] 结论:FTIR与1H、13C谱的数据结合分析表明，BD3749水不溶性胞外多糖为一种主链 由α_( 1，6)糖苷键连接而成，支链由α-( 1，3)和α-( 1，4)糖苷键连接而成的葡聚糖。
[0094] 实施例8明串珠菌水不溶性胞外多糖的连接键比例的测定
[0095] 将实施例1~5中制备的BD3749水不溶性多糖进行1H-NMR的检测，通过比较色谱图 (如图3Α)上Η-1 (α-(1，6))，α-(1，3)和α-( 1，4)吸收峰处的积分面积来确定各连接键的摩尔 比关系，各样品的测定结果如表1所示。
[0096] 表 1〇-(1，6)，€[-(1，3)和€[-(1，4)之间的摩尔比关系
[0097]
[0098]从表1可以看出，BD3749水不溶性多糖中各连接键的摩尔比例为α-(1，6):α-(1， 3) :α-(1,4) = 1:0.2~0.3:0.3~0.4。
[0099] 对比实施例1
[0100] 将实施例2中的接种量，合成培养基pH，培养温度，发酵时间，发酵振荡的速度、蔗 糖浓度以及浸提时的碱液浓度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的水不溶性胞 外多糖，各组产量如表2所不。
[0101] 表2不同方法制备所得水不溶性胞外多糖产量
[0102]
[0104] 从表2所示的结果中可以得出，将本发明所述胞外多糖的制备方法中接种量，合成 培养基PH，培养温度，发酵时间，发酵振荡的速度、蔗糖浓度以及浸提时的碱液浓度调整到 本发明保护范围之外的时候，所得胞外多糖的产量显著降低。以上所有原料和试剂均市售 可得。
[0105] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法包 括以下步骤： 1) 将肠膜明串珠菌（!^11(：〇11〇81：〇(3 1116 8 61^61'〇丨(16 8)1303749接种于番前汁鹿糖培养基 中，发酵培养获得发酵液； 2) 将步骤1)所得发酵液冷冻干燥后，取粉末用碱液浸提，取上清，调节上清pH值至7，取 沉淀，冷冻干燥即得。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的肠膜明串珠菌的制备方法 还包括肠膜明串珠菌BD3749活化获得肠膜明串珠菌种子的步骤。3. 如权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)所述的番茄汁蔗糖培养基由包括以 下步骤的方法制备:番茄榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清液，加入蔗糖加热溶解 后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。其中，所述过滤的方法较佳地为利用80~120目纱布过 滤取汁;所述煮沸的时间较佳地为1~10分钟，更佳地为3~8分钟，最佳地为5分钟;所述离 心的速度较佳地为4,000~12,000g，更佳地为6,000~10,000g，最佳地为8,000g，离心的时 间较佳地为8~12分钟，更佳地为9~11分钟，最佳地为10分钟;所述蔗糖的加入量较佳地为 5~30%，更佳地为10~20%，最佳地为10% ;所述灭菌的温度较佳地为110~135°C，更佳地 为115~125°C，最佳地为121 °C，所述灭菌的时间较佳地为10~30分钟，更佳地为15~25分 钟，最佳地为20分钟;所述pH值的调节方法较佳地为加入食品级碱调节pH值，所述食品级碱 较佳地是:Na2C03、NaHC03和NaOH中的一种或多种;所述pH值较佳地为5~8，更佳地为6~7， 最佳地为7。4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的肠膜明串珠菌的接种量为 1~5%，较佳地为2~4%，更佳地为3%，所述百分比为体积百分比。5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述发酵培养为振荡培养，振荡 的速度较佳地为100~300rpm，更佳地为150~250rpm，最佳地为200rpm;或者，所述的发酵 培养的发酵温度为15~37°C，较佳地为25°C~33°C，更佳地为30°C;或者，发酵时间为24~ 96小时，较佳地为48~84小时，更佳地为72小时。6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述碱液为NaOH溶液，所述NaOH 溶液的浓度为1~5M，较佳地为2~4M，更佳地为3M;和/或，步骤2)所述浸提时冻干粉末与碱 液的比例为1g:lmL~1g: 5mL，较佳地为1g: 2mL~1g: 4mL，更佳地为1g: 3mL。7. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述上清为离心取得，离心的速 度较佳地为8,000~15,00(^，更佳地为10,000~12,00(^，离心的时间较佳地为5~15分钟， 更佳地为8~10分钟;和/或，步骤2)所述pH为用酸液调节，所述酸液较佳地为HC1溶液，所述 HC1溶液浓度为1~3M，较佳地为1.5~2.5M，更佳地为2M。
【专利摘要】本发明公开了一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：1)将肠膜明串珠菌(Leuconostoc？mesenteroides)BD3749接种于番茄汁蔗糖培养基中，发酵培养获得发酵液；2)将步骤1)所得发酵液冷冻干燥后，取粉末用碱液浸提，取上清，调节上清pH值至7，取沉淀，冷冻干燥即得。该制备方法所用番茄汁蔗糖培养基主要原料为番茄，其来源广、成本低、天然安全，在降低物料成本的同时，提高了食品安全性，发酵菌种为肠膜明串珠菌单一菌种，上述组合有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制，其应用前景十分广阔。CGMCC No. 1006420141126
【IPC分类】C12P19/04, C12R1/01
【公开号】CN105483177
【申请号】CN201510971582
【发明人】吴正钧, 韩瑨, 徐晓芬, 高彩霞, 吴江
【申请人】光明乳业股份有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月21日