lane6，172bp和 187bp ；利用多重PCR体系对FI (1227 X 99S-C)进行扩增得到多态性条带大小为:lane7，172bp、187bp、320bp和450bp，电泳结果参见图1。
[0118]实施例2
[0119]本实施例为了检测构建的多重PCR体系在分离后代中的结果，具体实施步骤如下:
[0120](1)提取番茄叶片DNA
[0121]待测材料$2(1227\0^27774-0)，对所有待测植株进行单株取样；
[0122](2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty_3和ty_5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行扩增；
[0123]PCR扩增体系为:
[0124]lOng/yL模板DNA 2yL,
[0125]4pmmol/L 的引物对 P6-25-F2/P6-25-R5 与 ty5_17R/F 各 0.5yL,
[0126]mix酶10yL，
[ΟΙ27]双蒸水或三蒸水加至20yL;
[0128]PCR反应体系中所用引物为:
[0129]T0302R:AGTGTACATCCTTGCCATTGACT
[0130]T0302F:TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC；
[0131]ty5-17R:TAACAAAGCCCTCAAAGC
[0132]ty5-17F:GTCTCCGAAACGTAATCC；
[0133]多重PCR反应条件为:95°C预变性3min;每个循环95°C变性45sec，51°C退火45sec，72°C延伸45sec，共38个循环，最后72°C延伸lOmin;
[0134](3)PCR产物电泳检测;包括
[0135]a)制备聚丙烯酰胺凝胶，步骤如下:
[0136]玻璃板处理:KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水冲洗两遍；自然晾干;用95 %乙醇擦拭长短板；
[0137]固定玻璃板:长板处理面向上，短板处理面向下盖到长板上，用橡胶条固定两个板，插入垂直电泳仪支架，短板向里固定，即凹口板面向电泳液方向，用1 %的琼脂糖密封橡胶条与玻璃板之间的缝隙；
[0138]配制8 %丙烯酰胺胶溶液:30 %丙烯酰胺溶液:5.3mL ; 10 X TBE: 2mL ;双蒸水:12.7mL； TEMED:20yL； 10%APS:200yL；
[0139]灌胶:将电泳槽倾斜30度，缓缓地使胶溶液倒入两板间，等胶溶液快要溢出时，把玻璃板放平，用薄塑料板赶气泡，倒插梳子；
[0140]凝固:灌完胶后，放于室温让其自然凝固，观察胶边沿出现折射线就表明胶已凝固；凝胶可立即使用，或保存于室温24小时，4°C48小时；
[0141]b)聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下:
[0142]倒液:向电泳仪下端槽内倒1 X TBE约500mL，向上槽倒1 X TBE，使液面高于短板上沿。拔出梳子，并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净(因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则)；
[0143]上样:取1.6yLPCR产物上样;调节电压160V，电泳2.0，电泳完毕，关掉电泳仪，取下玻璃板；
[0144]c)聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色，步骤如下:
[0145]固定:固定液由0.5 %乙酸2.5mL、双蒸水450mL、10 %乙醇50mL组成;把经冷却的胶板置于盛上述有固定液的1.5L的塑料盘中，摇床震荡6min左右；
[0146]染色:染色液由硝酸银lg、双蒸水500mL组成;把清洗干净的胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡12min左右；
[0147]洗胶:把经染色的胶板置于盛有500mL双蒸水的塑料盘中清洗30s;倒掉清洗液，加入500mL双蒸水，双蒸水中加入120yL 10%的Na2S203，清洗30s。
[0148]显色:显色液由7.5gNa0H、37 % -40 %甲醛1.5mL、双蒸水500mL组成；把清洗干净的胶板置于盛有显色液的塑料盘中显色。显色时间根据条带和背景颜色深浅调整，达到DNA条带清晰的目的(一般5_6min);显色液用前可以先预冷至4-10°C，防止背景加深；
[0149]终止显色:把染色完毕的胶板放回盛有固定液的塑料盘中，反应3min。用双蒸水清洗两次，每次2min;
[0150]干胶:胶板用保鲜膜密封，置于室温自然干燥;条带统计、拍照留存；
[0151](4)对照电泳结果进行结果分析；
[0152]电泳结果如图2所示，1、2、8、14分别代表单株中含有纯合的ty-5，杂合的Ty-3;3代表单株中含有杂合17-3，不含有七7-5;4、7、11、13、16、20代表单株中含有纯合17-3，不含有ty-5; 5代表单株中含有纯合Ty-3合ty-5; 6、12、19代表单株中Ty-3和ty-5均为杂合基因型；
9、10、18代表单株中含有杂合ty-5，不含有Ty-3 ; 15、17代表单株中含有纯合ty-5，不含有Ty-3 ο
[0153]上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
【主权项】
1.一种番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其特征在于，其包括以下步骤: 1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA; 2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty-3和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增； 3)PCR产物电泳检测； 4)对待测番茄样品中是否含有Ty-3基因和ty-5基因进行鉴定。2.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤1)中的番茄叶取自育种、野生、分离群体番茄品种的番茄叶。3.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中，Ty-3引物为: P6-25-F2:GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC P6-25-R5:GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC； ty-5引物为: ty5-17R:TAACAAAGCCCTCAAAGC ty5-17F:GTCTCCGAAACGTAATCC。4.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中，多重PCR反应体系为: lOng/yL模板DNA 2yL， 4pmmol/L 的引物对P6-25-F2/P6-25-R5 与 ty5-17R/F各0.5yL， 1^叉酶1(^1^， 双蒸水或三蒸水加至20yL ； 多重PCR反应条件为:95°C预变性3min ；每个循环95°C变性45sec，51°C退火45sec，72°C延伸45sec，共38个循环，最后72°C延伸lOmin。5.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤3)电泳采用8%的聚丙烯酰胺凝胶，电泳的具体步骤包括: a)制备聚丙烯酰胺凝胶:KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水冲洗，晾干后用乙醇擦拭长短板;然后将长板处理面向上，短板处理面向下盖到长板上，用橡胶条固定两个板，插入垂直电泳仪支架，短板向里固定，即凹口板面向电泳液方向，用1 %的琼脂糖密封橡胶条与玻璃板之间的缝隙；在30 %的丙烯酰胺溶液加入10 XTBE、双蒸水、TEMED以及10 %的APS配置成8 %的聚丙烯酰胺溶液;然后将电泳槽倾斜30度，缓缓地使聚丙烯酰胺溶液倒入两板间，等胶溶液快要溢出时，把玻璃板放平，用薄塑料板赶气泡，倒插梳子;灌完胶后，放于室温让其自然凝固，观察胶边沿出现折射线就表明胶已凝固； b)聚丙烯酰胺凝胶电泳:向电泳仪下端槽内倒1X TB，向上槽倒1 X TBE，使液面高于短板上沿，拔出梳子，并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净;取PCR产物上样;调节电压160V，电泳1.5-2.0h，电泳完毕； c)聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色:把经冷却的胶板置于盛有固定液的塑料盘中，摇床震荡3-8min;然后将胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡10-15min;经染色的胶板用双蒸水清洗，然后用添加了浓度为10%的Na2S203的双蒸水清洗;将清洗干净的胶板置于显色液中显色，至DNA条带清晰后将显色完毕的胶板放回固定液中反应，反应完成后用双蒸水清洗，然后用保鲜膜密封，置于室温自然干燥，条带统计、拍照留存。6.根据权利要求5多重PCR检测方法，其特征在于，所述固定液由0.5%乙酸2.5mL、10 %乙醇50mL、双蒸水450mL组成;所述染色液由硝酸银与双蒸水组成，其中硝酸银与双蒸水的质量比为1:500。7.根据权利要求5多重PCR检测方法，其特征在于，所述显色液由7.5g NaOH、37 %-40 %的甲醛1.5mL、双蒸水500mL组成。8.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤4)对待测样品中Ty-3基因和ty-5基因进行鉴定方法具体步骤为:在步骤3)酶切后的多态性条带中大找出450bp和172bp条带，即分别对应Ty-3基因和ty-5基因。
【专利摘要】本发明公开了一种番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其包括：1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA；2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty-3和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；3)PCR产物电泳检测；4)对待测番茄样品中是否含有Ty-3基因和ty-5基因进行鉴定等步骤。本发明用于快速鉴定番茄材料中是否含有番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-3和ty-5，有利于对这两个基因进行聚合育种时，对抗病基因材料的筛选。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105463079
【申请号】CN201510916629
【发明人】王银磊, 赵统敏, 余文贵, 赵丽萍, 杨玛丽, 姜静, 李亚茹
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月10日