有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物。
[0084] 具体而言，基于编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgll469的基因的核苷酸序列， 用于获得NCgll469的N-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:1和2的引物对和用于获得 NCgll469的C-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:3和4的引物对如下表1构建。
[0085] [表1]
[0086]
[0087]使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板和两个引物对进行PCR，从 而分别获得N-末端区域和C-末端区域的PCR片段。将这些PCR片段电泳以获得期望的片段。 此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒、55°C下退火30秒和72°C下延伸30秒。如此获 得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和Sail处理，并且如此获得的C-末端区域的 片段用限制性内切酶Sail和Xbal处理。将如此处理的片段克隆入用限制性内切酶BamHI和 Xbal处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-NCgll469(K/0)。
[0088] 将质粒pDZ-NCgl 1469 (K/0)通过电穿孔转化入谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P内以获 得转化体。然后，将该转化体铺板(plate)并在包含卡那霉素（25μg/ml)和X-gal (5-溴-4-氯-3-二氢吲哚-D-半乳糖苷）的BHIS平板(37g/l Braine心浸液，91g/l山梨醇，2%琼脂)上 培养，用于菌落形成。从平板上形成的菌落，选择蓝色菌落作为引入有质粒pDZ-NCgll469 (K/0)的菌株。
[0089]将选择的菌株接种在CM培养基（10g/l葡萄糖，10g/l聚胨，5g/l酵母提取物，5g/l 牛肉膏，2.5g/l NaCl，2g/l尿素 ，pH 6.8)中在30°C下摇动培养8小时。随后，将每个细胞培 养物从10-4连续地稀释到ΙΟ#。然后，将稀释的样品铺板并在包含X-gal的固体培养基上培 养，用于菌落形成。
[0090]从形成的菌落，选择以相对低频率出现的白色菌落以制备通过缺失编码NCgl 1469 的基因而具有提尚的腐胺生广力的谷氣酸棒状杆菌菌株。如此制备的具有提尚的腐胺生广 力的谷氨酸棒状杆菌菌株被命名为KCCM11138P Δ NCgl 1469并且在2011年12月26日依照布 达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11240P。关于具有腐胺生产 力的棒状杆菌属某种微生物的制备的详细描述在韩国专利申请号10-2012-0003634中给 出，其公开内容以其全部通过引用并入。
[0091] 实施例1:腐胺输出蛋白的探查和具有腐胺抗性的文库克隆的选择
[0092] 谷氨酸棒状杆菌不具有腐胺生物合成途径。然而，当将外部鸟氨酸脱羧酶引入谷 氨酸棒状杆菌以具有生产腐胺的能力时，它产生和细胞外地分泌腐胺。这表明在棒状杆菌 属某种微生物的许多膜蛋白之中起腐胺通道作用的运载体的存在。
[0093] 为了从棒状杆菌属某种微生物分离和隔离腐胺输出蛋白，制备野生型谷氨酸棒状 杆菌ATCC13032的染色体文库。具体而言，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体用限制性内 切酶Sau3AI处理，进行不完全切割。分离3~5kb的基因片段，并将其克隆入用BamHI处理的 PECCG122载体(大肠杆菌和棒状杆菌属的穿梭载体;韩国专利公开号10-1992-0000933)。 [0094]将如此获得的棒状杆菌染色体文库转化入腐胺生产菌株一一根据参考实施例1的 谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P，然后选择在0.35M包含腐胺的基本培养基(在1升蒸馏水的基 础上，其包含l〇g葡萄糖，〇.4g MgS〇4.7H20,4g NH4Cl，lg KH2P〇4，lg K2HP〇4,2g尿素，10mg FeS〇4 · 7H2〇，lmg MnS〇4 · 5H2〇,5mg烟酰胺，5mg盐酸硫胺素，O.lmg生物素，ImM精氨酸，25mg 卡那霉素，0.35M腐胺，pH 7.0)中生长的菌株。从引入有棒状杆菌染色体文库的大约5.5 X 1〇5种转化体，选择413个菌落，然后每个文库克隆--其腐胺抗性也通过二次检测确 定一一被重新引入腐胺生产菌株。最终，选择一个克隆(B19)，其腐胺抗性通过三次检测确 定。使该克隆经受核苷酸序列分析。结果，发现在B19克隆中具有NCgl2522(图1)。
[0095]从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中作为腐胺输出蛋白分离的NCgl2522具有由SEQ ID N0:21表示的氨基酸序列，其由具有由SEQ ID N0:20表示的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0096] 实施例2:NCgl2522缺失菌株的制备和其腐胺生产力的检测
[0097] 〈2-1>从基于ATCC13032的腐胺生产菌株制备NCgl2522缺失菌株
[0098]为了检测谷氨酸棒状杆菌ATCC13032衍生的NCgl2522是否参与腐胺输出，构建缺 失编码NCgl2522的基因的载体。
[0099] 具体而言，基于编码NCgll469的基因的核苷酸序列--其由SEQ ID N0:20表示， 用于获得NCgll469的N-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:5和6的引物对和用于获得 NCgll469的C-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:7和8的引物对如下表2中构建。
[0100][表 2]
[0101]
[0102] 使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板和两个引物对进行PCR，从 而扩增NCgl2522基因的N-末端区域和C-末端区域的PCR片段。电泳这些PCR片段以获得期望 的片段。此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸30 秒。如此获得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和Sa 11处理，和如此获得的C-末端 区域的片段用限制性内切酶Sail和Xbal处理。将如此处理的片段克隆入用限制性内切酶 BamHI和Xbal处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)。
[0103] 将质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)通过电穿孔分别转化入参考实施例1和2的谷氨酸棒 状杆菌KCCM11138P和KCCM11240P中，从而获得转化体。然后，将该转化体铺板并在包含卡那 霉素（25μg/ml)和X-gal (5-溴-4-氯-3-二氢吲哚-D-半乳糖苷）的BHIS平板(37g/l Braine 心浸液，91g/l山梨醇，2%琼脂)上培养，用于菌落形成。从平板上形成的菌落，选择蓝色菌 落作为引入有质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)的菌株。
[0104]将选择的菌株在CM培养基（10g/l葡萄糖，10g/l聚胨，5g/l酵母提取物，5g/l牛肉 膏，2.5g/l NaCl，2g/l尿素 ，pH 6.8)中在30°C下摇动培养8小时。随后，将每个细胞培养物 从10-4连续地稀释到10-1()。然后，将稀释的样品铺板并在包含X-gal的固体培养基上培养，用 于菌落形成。从形成的菌落，选择以相对低频率出现的白色菌落以最终获得菌株，在该菌株 中编码NCgl2522的基因通过二次交换缺失。最终选择的菌株使用SEQ ID N0:5和8的引物对 经历PCR以确定编码NCgl2522的基因的缺失。谷氨酸棒状杆菌突变菌株分别被命名为 KCCM11138P ANCgl2522和KCCM11240P ANCgl2522。
[0105] 〈2-2>从基于ATCC13869的腐胺生产菌株制备NCgl2522缺失菌株
[0106] NCgl2522缺失菌株从基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的腐胺生产菌株制备，所述 菌株为具有与KCCM11138P和KCCM11240P相同基因型的DAB12-a(argF缺失，NCgll221缺失， 大肠杆菌speC引入，arg操纵子启动子替换；参见参考实施例1)和DAB12-b(argF缺失， NCgll221缺失，大肠杆菌speC引入，arg操纵子启动子替换，NCgll469缺失，参见参考实施例 2)，KCCM11138P和KCCM11240P为基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的腐胺生产菌株。
[0107]具体而言，为了检测编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因序列 和由其表达的蛋白质，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板和SEQ ID N0: 5和8的引物对进行PCR。此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和 72°C下延伸2分钟。将如此获得的PCR产物通过电泳分离，并进行测序。结果，发现编码谷氨 酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因的核苷酸序列由SEQIDN0 :22表示，和由此 编码的蛋白质的氨基酸序列由SEQ ID N0:23表示。当谷氨酸棒状杆菌ATCC13032衍生的 NCgl2522的氨基酸序列与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的氨基酸序列相比较 时，发现它们具有98%的序列同源性。
[0108] 为了缺失编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因，以与实施例Οι〉 相同的方式，使用谷氨酸棒状杆菌 ATCC13869 的基因组 DNA 作为模板和表 2 的两个引物对 进行PCR，从而分别扩增NCgl2522基因的Ν-末端区域和C-末端区域的PCR片段。将这些PCR片 段电泳以获得期望的片段。此时，进行PCR反应30个循环：95°C下变性30秒，55°C下退火30 秒，和72°C下延伸30秒。如此获得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和Sail处理， 并且如此获得的C-末端区域的片段用限制性内切酶Sail和Xbal处理。将如此处理的片段克 隆入用限制性内切酶BamHI和Xbal处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-2 ' NCgl2522(K/0)。
[0109] 以与实施例〈2-1>中相同的方式，将质粒pDZ-2'NCgl2522(K/0)分别转化入谷氨酸 棒状杆菌DAB12-a和DAB12-b。选择其中编码NCgl2522的基因被缺失的菌株。如此选择的谷 氨酸棒状杆菌突变菌株分别被命名为DAB12-a ANCgl2522和DAB12-b ANCgl2522。
[0110] <2-3>NCgl2522缺失菌株的腐胺生产力的评估
[0111] 为了确定腐胺生产菌株中NCgl2522缺失对腐胺生产力的影响，将实施例〈2-1>和〈 2-2>中制备的谷氨酸棒状杆菌突变菌株的腐胺生产力进行比较。
[0112] 具体而言，将4种类型的谷氨酸棒状杆菌突变体（KCCM11138P ANCgl2522、 KCCM11240P ANCgl2522、DAB12-a ANCgl2522和DAB12-b ANCgl2522)和4种类型的亲本 菌株(1(01111138?、1(01111240?、04812-3和04812-13)分别在包含11111精氨酸的01平板培养基 (1升基础上，1%葡萄糖，1%聚胨，0.5%酵母提取物，0.5%牛肉膏，0.25%NaCl，0.2%尿 素 ，100μΙ 50%Na0H，2%琼脂，pH 6.8)上铺板，并在30°(3下培养24小时。将1个接种环 (platinum loop)的如此培养的每种菌株接种在25ml效价培养基（1升基础上，8%葡萄糖