一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和微生物发酵技术领域。具体地说，本发明涉及通过增强合 适的苏氨酸生产菌株中的丙丽酸駿化酶和天冬氨酸激酶的酶活来提高k苏氨酸的转化率 的方法；丙丽酸駿化酶和天冬氨酸激酶得到增强的转化率提升的k苏氨酸生产菌株；W及 本发明还涉及该菌株的用途。
【背景技术】
[0002] k苏氨酸是人类和动物营养中最重要的必需氨基酸，在食品工业、养殖业和饲料 工业中有着十分重要的地位。近年来，其市场需求稳步增加，世界市场销售量已经突破百万 吨规模。目前，苏氨酸主要采用微生物发酵法来生产。在大肠杆菌中心苏氨酸的合成途径 是W天冬氨酸为前体，通过五步反应生产苏氨酸（如图1所示）。
[0003] 工业上主要由大肠杆菌进行发酵生产。由于苏氨酸在经济生活中的重要性，研究 人员不断对生产苏氨酸的大肠杆菌进行改造。目前的苏氨酸生产菌株主要通过诱变，筛选 等方法来进行改善，但近些年来，随着基因工程技术的发展，代谢工程技术越来越多地应用 于苏氨酸大肠杆菌改造。
[0004] 目前已经有许多报道通过改造大肠杆菌的基因来提高k苏氨酸的产量的方法。 EP1687408A1报道了将大肠杆菌苏氨酸操纵子启动子改造为组成型启动子后增强了大肠杆 菌的苏氨酸生产能力；EP1179597A1报道了通过增加转氨酶和磯酸帰醇式丙丽酸駿化酶的 酶活，增强了苏氨酸的合成能力；CN1323171C报道了在大肠杆菌中增强来源于谷氨酸棒杆 菌的丙丽酸駿化酶提高了改造菌株的氨基酸产量，该专利中也提及通过此方法可W提高苏 氨酸产量。
[0005] 虽然苏氨酸生产菌株产酸量是衡量菌株水平的一个重要指标，糖酸转化率对氨基 酸生产企业来说更加重要，因为它是影响生产成本的更关键的因素，尤其是在目前能源、生 产原料价格日益上涨，企业在盈利空间被进一步压缩的巨大压力下，提升苏氨酸生产菌株 的糖酸转化率更为迫切。然而，目前本领域对于如何提高糖酸转化率的研究甚少，已有的研 究仅仅着眼于通过发酵工艺控制的优化来达到提升糖酸转化效率的目的，在代谢工程改造 方面的研究还比较少。
[0006] 此外，由于k苏氨酸亦可作为其他代谢物，例如k异亮氨酸合成的前体，大肠杆 菌中异亮氨酸经过苏氨酸脱氨酶等走步反应催化获得异亮氨酸，如果能够获得k苏氨酸 产量和转化率均显著提高的生产菌株，对于具有经济价值的其它产物的生产也都具有非常 重要的意义。
[0007] 因此，本领域应当继续开发新的方法，不仅能够提高苏氨酸的产量，更要能够显著 的提高从葡萄糖到苏氨酸的转化效率。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一是提供一种提高k苏氨酸转化率的方法，或构建转化率提升 的k苏氨酸产生菌株的方法，采用该方法可w从本身能产生k苏氨酸的菌株、本身不产生 k苏氨酸的菌株、或本身经修饰而产生k苏氨酸的菌株出发，构建转化率显著提高的k苏 氨酸生产菌株。
[0009] 本发明的另一目的是提供利用本发明方法构建的转化率提升的k苏氨酸产生菌 株，所述菌株在生产k苏氨酸时的转化率显著提高。
[0010] 本发明的再一目的是提供利用本发明的转化率提升的k苏氨酸产生菌株高转化 率地产生k苏氨酸的方法。
[0011] 在第一方面，本发明提供一种提高心苏氨酸转化率的方法，或构建转化率提升的 k苏氨酸生产菌株的方法，所述方法包括：
[0012] a)增强适合生产k苏氨酸的菌株中天冬氨酸激酶和丙丽酸駿化酶的活性。
[0013] 在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶是：
[0014] (A)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肤；或
[0015] 度）将SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15 个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具 有（A)所述多肤功能的由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肤衍生的多肤；
[0016] 所述丙丽酸駿化酶是：
[0017] 似具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肤；或
[0018] (D)将SEQ ID NO:6所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15 个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具 有（C)所述多肤功能的由SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肤衍生的多肤。
[0019] 在进一步优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所 示；所述丙丽酸駿化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0020] 在另一优选的实施方式中，所述增强酶的活性可通过W下方法之一或组合来实 现；表达该酶的同源或异源的编码基因，和/或增加所述酶的编码基因的拷贝数，和/或 改造所述编码基因的启动子W增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使 RNA的翻译调控区W增强翻译强度，和/或通过SD序列改造一增加所述编码基因的转录强 度，和/或通过改造其调控蛋白来增加所述编码基因的表达强度。
[0021] 在另一优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的编码基因如SEQ ID N0:3所示；所 述丙丽酸駿化酶的编码基因如SEQ ID NO:5所示。
[0022] 在优选的实施方式中，所述方法在步骤a)之前还包括；将编码天冬氨酸激酶/高 丝氨酸脱氨酶、编码高丝氨酸激酶和编码苏氨酸合成酶的基因导入适合k苏氨酸生产的 网株。
[0023] 在优选的实施方式中，包含编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氨酶、编码高丝氨酸 激酶和编码苏氨酸合成酶的基因表达框的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示；其编码的氨基 酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0024] 在优选的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的转化率和/或k苏氨酸产 量。
[0025] 在第二方面，本发明提供一种转化率提升的k苏氨酸生产菌株，所述菌株中的天 冬氨酸激酶和丙丽酸駿化酶的活性增强。
[0026] 在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶是：
[0027] (A)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肤；或
[0028] 度）将SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15 个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具 有（A)所述多肤功能的由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肤衍生的多肤；
[0029] 所述丙丽酸駿化酶是：
[0030] 似具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肤；或
[0031] (D)将SEQ ID NO:6所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15 个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具 有（C)所述多肤功能的由SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肤衍生的多肤。
[0032] 在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述 丙丽酸駿化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0033] 在另一优选的实施方式中，所述菌株为埃希氏菌属巧scherichia)的细菌、或谷 氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutami州m);优选大肠杆菌。
[0034] 在优选的实施方式中，所述菌株本身具有k苏氨酸合成能力。
[0035] 在优选的实施方式中，所述菌株通过本发明第一方面所述的方法构建。
[0036] 在第Η方面，本发明提供一种产生k苏氨酸的方法，所述方法包括：
[0037] 1)培养本发明第二方面所述的k苏氨酸生产菌株，从而得到k苏氨酸；和 [003引2)从1)的发酵培养体系中获得k苏氨酸。
[0039] 在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述心苏氨酸生产菌株的用途，所述菌 株用于产生k苏氨酸和/或产生W k苏氨酸为前体的下游产物。
[0040] 在优选的实施方式中，所述W k苏氨酸为前体的下游产物是k异亮氨酸。
[0041] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0042] 图1是W天冬氨酸为前体，通过五步反应生产苏氨酸的示意图；
[0043] 图2是重组质粒pwsk29-pyc-lysC的构建过程的示意图。
【具体实施方式】
[00