richia coli, Gene, Volume 100, April 1991, Pages 195-199)，连接成功后获得的质 粒命名为pwsk29-pyc，经华大测序证明序列正确，pyc过表达载体构建完毕。
[0116] 设计带启动子、SD序列和酶切位点的引物CGCGATATCTTTACGGCTAGCTCAGTCCTAG GTACTATGCTAGCACTAGTGAAAGAGGAGAAATACTAG ATGTCTGAAA TTGTTGTCTC CAAATTTG(SEQ ID N0:11)和 CGCGATATTTACTCAAAC AAATTACTAT GCAGTT(SEQ ID 側：12)，利用^上引物，^ MG1655基因组DNA为模板扩增lysC基因（lysC编码基因，其氨基酸序列为SEQ ID N0:4,其 核巧酸序列为SEQ ID NO: 3);最后所获得的DNA片段带上EcoRV的酶切位点。利用EcoRV 酶切获得DM片段，然后利用T4连接酶连接于EcoRV酶切后的pwsk29质粒，连接成功的质 粒命名为pwsk29-lysC，经华大测序证明序列正确，lysC过表达载体构建完毕。
[0117] 利用EcoRV酶切pwsk29-lysC获得DNA片段，然后利用T4连接酶连接于EcoRV酶 切后的pwsk29-pyc质粒，连接成功的质粒命名为pwsk29-pyc-lysC，经华大测序证明序列 正确，pyc和lysC共表达载体构建完毕。
[011引实施例3.重组菌株的构建W及苏氨酸产量的比较
[0119] 将上述构建的重组质粒pwsk29-pyc、pwsk29-lysC和pwsk29-pyc-lysC转化大肠 杆菌MGt虹ABC,涂布Amp抗性LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得 重组菌株MGt虹1、MGt虹2、MGt虹3。将上述重组菌单菌落分别接种5血含有100 μ g/mL氨 予青霉素的LB液体培养基，37°C，220rpm培养12h。按照初始0D为0. 05转接装有20mL发 酵培养基的500mL Η角瓶，37°C，250rpm培养3化后收集发酵液，检测苏氨酸和葡萄糖的浓 度。
[0120] 其中发酵培养基主要成分为；葡萄糖50g/L、硫酸倭lOg/L、磯酸二氨钟2g/L、酵 母粉3g/L、走水合硫酸镇0. 5g/L、五水合硫酸亚铁0.0 lg/L、五水合硫酸儘0.0 lg/L、MOPS 0. 4M。
[012。 各重组菌苏氨酸产量结果见表1，对照菌株MG化rABC中苏氨酸产量仅为0. 59g/L， 而lysC和pyc协同表达的MGt虹3菌株苏氨酸产量为1. 38g/L，比出发菌株提高234%，明 lysC和pyc的协同表达可W显著提高苏氨酸的产量。
[012引与此同时，相比于出发菌株MGt虹ABC,MGt虹3菌株的转化率提高246%，说明lysC 和pyc协同表达不仅仅对大肠杆菌的苏氨酸产量有提升作用，更显著提高了转化率。
[0123] 表2.不同菌株摇瓶发酵数据
[0124]
[0125]
[0126] 实施例4.在BW25113菌株中重复验证
[0127] 重组菌株的构建：分别将上述质粒pwsk29-pyc、pwsk29-lysC和pwsk29-pyc-lysC 转化大肠杆菌BWt虹ABC,涂布Amp抗性LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分 别获得重组菌株BWt虹1、BWt虹2、BWt虹3。
[012引各重组菌摇瓶发酵及苏氨酸和葡萄糖检测方法同上，结果见表3,从表中可W看出 各重组菌与相应的MG1655重组菌产量及变化基本一致，lysC和pyc协同表达的BWt虹3菌 株苏氨酸产量为2. 04g/L，葡萄糖转化率更是达到9. 00 %，分别比出发菌株BWt虹ABC提高 272%和259%，表明本发明提供的方法同样适用于大肠杆菌其他菌株。
[0129] 表3.不同菌株摇瓶发酵数据
[0130]
[0131] 本发明的方法W及所得到的苏氨酸生产菌株出乎意料地显著提高了转化率，苏氨 酸产量也有所提高，从而在表观上和实质上都降低了企业运营成本、提升了经济效益，具备 重大的经济意义和社会意义。
[0132] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考郝样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，送些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种提高L-苏氨酸转化率的方法，所述方法包括增强适合生产L-苏氨酸的菌株中 天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天冬氨酸激酶是： (A) 具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肽；或 (B) 将SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、 更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有 (A)所述多肽功能的由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽； 所述丙酮酸羧化酶是： (C) 具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；或 (D) 将SEQ ID N0:6所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、 更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有 (C)所述多肽功能的由SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示；所述丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述菌株为埃希氏菌属 (Escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum);优选地，所述菌 株是大肠杆菌。5. -种L-苏氨酸生产菌株，所述菌株中的天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性增强。6. 如权利要求5所述的L-苏氨酸生产菌株，其特征在于，所述天冬氨酸激酶是： (A) 具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肽；或 (B) 将SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、 更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有 (A)所述多肽功能的由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽； 所述丙酮酸羧化酶是： (C) 具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；或 (D将SEQ ID NO:6所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更 优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有（C) 所述多肽功能的由SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。7. 如权利要求6所述的L-苏氨酸生产菌株，其特征在于，所述天冬氨酸激酶的氨基酸 序列如SEQ ID N0:4所示；所述丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。8. 如权利要求5-7中任一项所述的L-苏氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株为埃希 氏菌属（Escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum);优选地， 所述菌株是大肠杆菌。9. 一种生产L-苏氨酸的方法，所述方法包括： 1) 培养权利要求5-8中任一项所述的L-苏氨酸生产菌株，从而得到L-苏氨酸；和 2) 从1)的发酵培养体系中获得L-苏氨酸。10. 权利要求5-8中任一项所述的L-苏氨酸生产菌株的用途，所述菌株用于产生L-苏 氨酸和/或产生以L-苏氨酸为前体的下游产物。
【专利摘要】本发明公开了一种提高L-苏氨酸转化率的方法，所述方法增强L-苏氨酸生产菌株中的丙酮酸羧化酶和天冬氨酸激酶的酶活，从而显著提高所述菌株产生苏氨酸时的糖酸转化效率。本发明还公开了利用所述方法获得的转化率提升的L-苏氨酸生产菌株以及利用所述菌株生产L-苏氨酸以及以L-苏氨酸为前体的其它下游产物的方法。
【IPC分类】C12N15/70, C12R1/19, C12P13/08, C12R1/185, C12N9/12, C12N1/21, C12N9/00, C12R1/15
【公开号】CN105505969
【申请号】CN201410504828
【发明人】郑平, 曹国强, 马红武, 张彦飞, 孙际宾, 马延和
【申请人】中国科学院天津工业生物技术研究所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月26日