44] 发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现通过增强天冬氨酸激酶和丙丽酸 駿化酶可W大幅度提高苏氨酸生产菌株的转化率。在此基础上完成了本发明。
[004引术语定义
[0046] 本文所用的术语"外源性"是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，通过转 化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的编码基因，则该基因对于该菌株是"外源 性"的。
[0047] 本文所用的术语"增强"是指增加、提高、增大或升高某种蛋白，例如酶的活性。鉴 于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员也不难理解本文所用的"增强"还应包括通过 表达酶的异源编码基因而增强其活性。在具体的实施方式中，增强酶的活性可w通过表达 酶的内源或异源性编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因 的启动子W增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区 或稀有密码子W增强翻译强度，和/或修改编码基因本身W增强mRNA稳定性、蛋白质稳定 性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现。
[0048] 天冬氨酸激酶（lysC)和丙丽酸駿化酶（pyc)
[0049] 本文所用的术语"天冬氨酸激酶"是指由lysC基因编码，具有天冬氨酸激酶活性， 可催化天冬氨酸到天冬氨酸磯酸的酶，其是苏氨酸合成途径中的关键酶。本文所用的术语 "丙丽酸駿化酶"是指由pyc基因编码，可催化丙丽酸到草醜己酸的酶。大肠杆菌中天然不 存在此酶，其属于外源性蛋白。本文实施例中涉及的pyc基因来源于菌株化izobuim etli 652。
[0050] 基于现有技术的知识，本领域普通技术人员不难知晓，在多肤的某些区域，例如非 重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到 的序列并不会影响其活性（可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene,第四版， 1987，The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施送种替 换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。
[0051] 因此，在具体的实施方式中，本发明的天冬氨酸激酶可W是；（a)具有SEQ ID N0:4 所示氨基酸序列的多肤；或化）将SEQ ID N0:4所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20 个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的，具有（a)所述多肤功能的由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肤衍生的多 肤。在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0052] 类似地，在具体的实施方式中，本发明的丙丽酸駿化酶可W是；(a)具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肤；或（b)将SEQ ID N0:6所示氨基酸序列经过一个或几个，优 选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的，具有（a)所述多肤功能的由SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肤衍 生的多肤。在优选的实施方式中，本发明的丙丽酸駿化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所 /J、- 〇
[0053] 在本发明中，本发明的天冬氨酸激酶或丙丽酸駿化酶包括与氨基酸序列SEQ ID N0:4或6所示的天冬氨酸激酶或丙丽酸駿化酶相比，有至多20个、较佳地至多10个，再佳 地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而 形成的突变体。送些保守性变异的突变体可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。
[0054]
[00 巧]
[0056] 本发明还提供了编码本发明多肤的多核巧酸。术语"编码多肤的多核巧酸"可W 是包括编码此多肤的多核巧酸，也可W是还包括附加编码和/或非编码序列的多核巧酸。
[0057] 因此，本文所用的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……构成"、"基 本上由......构成"、和"由......构成";"主要由......构成"、"基本上由......构成"和"由......构 成"属于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
[0058] t虹A、t虹B和t虹C基因
[0059] 本文所述的t虹A基因编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氨酶，t虹B基因编码高丝 氨酸激酶，thrC基因编码苏氨酸合成酶。
[0060] 在k苏氨酸生产领域，采用t虹A基因、t虹B基因和t虹C基因过表达的菌株是常 规手段。Η种基因处于同一基因表达框中（thrABC)，因此，可W克隆得到包含它们的基因表 达框，连接入表达载体，从而得到Η种基因的过表达载体。
[0061] 在具体的实施方式中，上述基因表达框的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示；其编 码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。基于现有技术的知识和本发明的教导，本领域技术 人员应该理解，本发明的创新之处并不在于t虹A基因、t虹B基因和t虹C基因；因此，实施 例中所用的SEQ ID N0:1所示核巧酸序列仅仅是举例的目的，来自其它物种的、与SEQ ID N0:1所示核巧酸序列有一定差异的核巧酸序列也可W应用于本发明，只要它们具备与SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列相同的功能。
[0062] 本发明的转化率提升的k苏氨酸生产菌株
[0063] 本发明人出乎意料的发现天冬氨酸激酶和丙丽酸駿化酶的活性增强的菌株的糖 酸转化率显著提高。
[0064] 因此，本发明提供其中天冬氨酸激酶和丙丽酸駿化酶的活性增强的k苏氨酸生 产菌株。
[0065] 在具体的实施方式中，所述天冬氨酸激酶是：
[006引 （A)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肤；或
[0067] 度）将SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15 个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具 有（A)所述多肤功能的由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肤衍生的多肤；
[0068] 所述丙丽酸駿化酶是：
[006引 似具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肤；或
[0070] (D)将SEQ ID NO:6所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15 个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具 有（C)所述多肤功能的由SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肤衍生的多肤。
[0071] 在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述 丙丽酸駿化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0072] 本发明的菌株可W是本身具有k苏氨酸合成能力；也可W是本身不具有，经改造 或修饰而具有k苏氨酸合成能力。
[0073] 在具体的实施方式中，所述菌株选自埃希氏菌属巧scherichia)的细菌、或谷氨 酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)。在优选的实施方式中，所述菌株是大肠杆菌 (Escherichia coli)。
[0074] 本发明的转化率提升的k苏氨酸菌株具备优异的生产特性本发明的菌株对糖酸 的转化率得到显著提高。
[0075] 在具体的实施方式中，与天冬氨酸激酶和丙丽酸駿化酶的活性增强前相比，本发 明菌株发酵产生k苏氨酸的糖酸的转化率增加50% W上；优选地，增加100% W上；最优 选地，增加200%。
[0076] 本发明的转化率提升的心苏氨酸菌株的用途
[0077] 基于本发明的教导，本领域技术人员会知晓本发明的转化率提升的心苏氨酸生 产菌株对糖酸的转化率也显著提高，同时k苏氨酸产量也有一定程度提高。而基于现有技 术知识，本领域技术人员可进一步明白，本发明的转化率提升的心苏氨酸生产菌株还可用 于产生W k苏氨酸为前体的衍生物，例如k异亮氨酸。
[0078] 转化率提升的k苏氨酸生产菌株的构建
[0079] 发明人出乎意料地发现通过增强天冬氨酸激酶和丙丽酸駿化酶可W大幅度提高 苏氨酸生产菌株的转化率，基于此，本发明提供一种转化率提升的k苏氨酸生产菌株的构 建方法，所述方法包括；增强适合生产k苏氨酸的菌株中天冬氨酸激酶和丙丽酸駿化酶的 活性。所述天冬氨酸激酶和丙丽酸駿化酶可W是W上"天冬氨酸激酶（lysC)和丙丽酸駿化 酶（pyc)"部分所述。
[0080] 基于现有技术知识，本领域技术人员知晓增强适合生产k苏氨酸的菌株中天冬 氨酸激酶和丙丽酸駿化酶的活性的各种技术手段。在具体的实施方式中，