所述增强酶的活 性可通过W下方法之一或组合来实现；表达同源或异源的该酶的编码基因，和/或增加所 述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子W增强转录启动速 度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区W增强翻译强度，和/或通过 SD序列改造一增加所述编码基因的转录强度，和/或通过改造其调控蛋白来增加所述编码 基因的表达强度。
[0081] 在另一具体的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的转化率和/或k苏氨 酸产量W验证所得菌株。
[0082] 基于上文所述，本领域技术人员可W理解，本发明的转化率提升的k苏氨酸生产 菌株的构建方法适用于各种菌株，只要该菌株适于产生k苏氨酸。
[0083] 鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还应明白本发明是通过增强起始 菌株中天冬氨酸激酶和丙丽酸駿化酶的活性实现的。因此，只要通过W上手段来构建或 改造菌株，进而提高产生心苏氨酸时的转化率或由此得到的菌株均应落在本发明的保护 范围内，本发明的保护范围并不限于实施例中采用的具体方法和得到的示例性菌株；换言 之，本领域技术人员可W采用任何已知的方法，只要该方法能够增强上述两个酶的活性，送 样的构建方法W及所构建的转化率提升的k苏氨酸生产菌株均应落在本申请的保护范围 内。
[0084] 鉴于本发明的发明点W及本领域的现有技术知识，本领域技术人员还应知晓本发 明的起始菌株可W是本身能产生k苏氨酸的菌株，也可W是本身不产生k苏氨酸的菌株， 还可W是本身经改造或修饰而产生k苏氨酸的菌株。
[0085] 因此，在进一步的实施方式中，本发明的方法在增强起始菌株中天冬氨酸激酶和 丙丽酸駿化酶的活性的步骤（a)之前，还可W包括将编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氨酶、 编码高丝氨酸激酶和编码苏氨酸合成酶的基因导入适合k苏氨酸生产的菌株的步骤。
[0086] 本发明的优点：
[0087] 1.本发明菌株产生k苏氨酸时的转化率大大提高；
[0088] 2.本发明菌株的k苏氨酸产量也得到一定程度的提高；
[0089] 3.通过增强起始菌株中天冬氨酸激酶和丙丽酸駿化酶的活性来显著提高糖酸转 化率，为工程改造 k苏氨酸生产菌株提供了新的思路；
[0090] 4.本发明构建的k苏氨酸菌株无论在表观上，还是在实质上都产生了降低企业 运营成本、提升经济效益的技术效果，因而具备重大的经济意义和社会意义。
[0091] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，送些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆；实验室手册（New York:Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0092] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0093] 材料与方法
[0094] 本发明实施例所用的DNA聚合酶是购自北京全式金公司的化s1:p化；
[0095] 限制性内切酶及DNA连接酶等均购自化rmentas公司；
[0096] 酵母粉和蛋白腺购自英国化oid公司产品；
[0097] 琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；
[0098] 葡萄糖W及其他常用化学试剂均购自国药；
[0099] 质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，相关操作均严格 按照说明书执行；
[0100] 质粒构建测序验证由华大基因（北京）完成；
[0101] D册α感受态细胞购自北京全式金公司；
[0102] LB培养基成分；酵母粉5g/l，蛋白腺10g/l，^Cl lOg/l，固体培养基中添加2%的 琼脂粉；抗生素浓度为：氨予青霉素100 μ g/mL，卡郝霉素30 μ g/mL。
[0103] 苏氨酸的检测方法；利用高效液相色谱的方法进行检测。
[0104] 葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检测。
[0105] 转化率的计算：转化率也叫物料转化率，数值上等于发酵过程中所消耗的葡萄糖 与发酵结束时产生的苏氨酸总量之比值，常用百分比表示，可W是摩尔比（mol% )，也可W 是重量比（wt%)。本专利采用重量比。
[0106] 实施例
[0107] 实施例1.构建过表达thrABC基因的苏氨酸生产菌株
[0108] 发明人首先构建了能够生产苏氨酸的菌株，通过增强大肠杆菌中thrA、t虹B和 t虹C基因的表达来实现。构建了能够过表达t虹A、t虹B和t虹C基因的载体，将其导入大肠 杆菌 MG1655(获自 ATCC 700926,可参考 Blattner FR 等，The complete genome sequence of Escherichia coli Κ-12. Science 277:1453-62(1997))，和 BW25113(来源于 CGSC(美 国耶鲁大学大肠杆菌保藏中必）），从而构建能够生产苏氨酸的大肠杆菌菌株MGt虹ABC。
[0109] 具体过程如下：
[0110] 37°C，将大肠杆菌MG1655在LB培养基中，W 20化pm培养12-1化，然后收集细胞。 采用Biomiga基因组小提试剂盒提取基因组DNA。W大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过 PCR获得野生型t虹ABC基因表达框。
[01U] PCR 扩增：W CGCGGATTCAGCTTTTCAT TCTGACTGCA ACGGGC(沈Q ID N0:7)和 GCGGAGCTCTTACTGATGA TTCATCATCA ATTTACG(SEQ ID N0:8)为引物，从大肠杆菌 MG1655 基 因组DNA上扩增thrABC基因（野生型thrABC的编码基因，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 2， 其核巧酸序列为SEQ ID NO: 1);最后所获得的DM片段带上BamHI和SacI的酶切位点。 通过BamHI和SacI双酶切获得DNA片段，利用T4连接酶连接于BamHI和SacI双酶切后的 pt;rc99A 质粒（参考文献 Amann, E. , Ochs, B.,和 Abel, K. (1988) Gene (Amst.) 69, 301-315)， 连接成功的质粒命名为ptrc-t虹ABC,经华大测序证明序列正确。
[0112] 将构建好的质粒ptrc-t虹ABC转化野生型大肠杆菌MG1655,感受态细胞的制备和 转化过程参考J.萨姆布鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。转化成功的转化 子命名为MGt虹ABC,作为苏氨酸生产的对照菌株。
[0113] 将上述构建好的质粒ptrc-t虹ABC转化大肠杆菌BW25113 (来源于CGSC(美国耶 鲁大学大肠杆菌保藏中必）），涂布Kan抗性LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验 证，获得重组菌株BWt虹ABC,作为能够生产苏氨酸的对照菌株。
[0114] 实施例2.构建丙丽酸駿化酶pyc和天冬氨酸激酶lysC共表达质粒
[0115] 37°C，将菌株根瘤菌化izobuim etli CFN42(来源于菌种保藏中必DSMZ)在LB 培养基中，200rpm，培养12-1化，然后收集细胞。采用Biomiga基因组小提试剂盒提取 基因组DNA。设计带启动子、SD序列和酶切位点的引物GCCGTCGACTTTACGGCTAGCTCAGTC CTAGGTACTATGCTAGCACTAGTGAAAGAGGAGAAATACTAG ATGCCCATAT CCAAGATACT CGTTG (SEQ ID N0:9)和 CGCGGTACCAACAGCCTGACTTTACACAATCGG(沈Q ID NO: 10)，利用 W 上引物，W 化izobuim etli基因组DNA为模板扩增pyc基因（pyc编码基因，其氨基酸序列为SEQ ID NO:6,其核巧酸序列为SEQ ID NO:5);最后所获得的DM片段带上Sail和化nl的酶切位 点。利用Sail和化nl双酶切获得DNA片段，然后利用T4连接酶连接于Sail和化nl双 酶切后的 pwsk29 质粒（参考文献 Rong 化 Wang, Si化巧 R.Kushner, Construction of vers曰tile low-copy-number vectors for cloning, sequencing 曰nd gene expression in Esche