融合铁蛋白在疫苗和其他方面的应用
【专利说明】融合铁蛋白在疫苗和其他方面的应用
[00011 本申请是2003年5月12日递交的申请号为03813504.3，发明名称为"融合铁蛋白在 疫苗和其他方面的应用"的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本专利申请拥有60，379，145号美国临时专利的权益，60，379，145号临时专利申请 于2002年5月10日提交，该专利申请的全文在此通过引证被并入本文。 发明领域
[0004] 本发明通常涉及融合铁蛋白，特别是在铁蛋白内部和外部的N端和/或C端融合其 他蛋白或肽片段形成能够自组装的融合蛋白，以及该类融合蛋白在作为疫苗和其他方面的 应用，包括运输氧气以及治疗性导入药物和其他治疗药剂。
[0005] 发明背景
[0006] 铁蛋白含有高度保守的24个亚基，这些亚基存在于所有的动物、细菌和植物中。铁 蛋白的主要生理作用是控制多核Fe(III) 203形成的速度和定位。（见Theil，E.C.等人在 《Adv · Enzymol · Re lat .Areas Mo l.Biol·》上发表的文章，1990,63:421-449 ; Harrison， Ρ·Μ·，Lilley，T.H.等人在Loehr Τ·Μ·编著的《Weinheim:VCH》中的文章，1990,33-452)该控 制作用是通过生物矿化作用，将水合铁离子和质子运进和运出含无机物的内核实现的。通 过这一机制使铁蛋白积累的铁离子强度大于生理状态下可溶性的游离铁离子强度。生物矿 化作用的速度直接与每个铁蛋白颗粒内的Η亚基和L亚基（即所谓的轻链和重链)的比例相 关，Η亚基含量增加时表现出铁离子储存速度增加的趋势。蛋白颗粒的组成差异具有组织特 异性，并影响铁的氧化代谢、核心形成和铁循环的机制。比如，血清中的铁蛋白主要由L链组 成，来自于心脏的铁蛋白Η链含量较高。铁蛋白矿化核心为不同的氧化酶提供铁离子，而且 起到还原的作用。
[0007] 每个铁蛋白由24个亚基组成，每个亚基含有432个对称体，直径125埃，颗粒厚度约 为25埃，中空的内部核心直径约为80埃(图1)。典型的铁蛋白单体含有至少两个异构体，由Η 链和L链组成，二者在氨基酸序列上不同。在许多脊椎动物包括人中已经确定Η亚基和L亚基 的长度，这两种结构体通常存在于已经确证的铁蛋白中。每个铁蛋白亚基分子量大约为17 道尔顿，具有束状螺旋的拓扑结构，包含4个反向平行螺旋基序和一个短螺旋(C端螺旋），该 螺旋大致与第4个束状螺旋的长轴垂直。依据惯例从Ν端开始分别将螺旋标记为"A，Β，C，D和 Ε" Α端序列与颗粒第3个折叠轴相邻并明显延伸到颗粒表面，而Ε螺旋与第4个折叠轴挤压 在一起，其C端延伸到颗粒核心。挤压的结果是在蛋白颗粒表面形成2个孔。位于第四个折叠 的孔大约有4-5埃，主要为疏水性;而位于第三个折叠的孔直径略大，是6.0埃，主要为亲水 性。这两个孔或其中一个可能是水合铁离子扩散出入颗粒的通道。
[0008] 以前关于铁蛋白的研究工作，如5，248，589; 5，358，722和5，304，382号美国专利， 通过引证被并入本文均列在参考文献中，主要集中在蛋白外壳和内核的生理作用方面，如 除了含铁水合物以外的物质可能定位于壳内。通过差示扫描量热法研究显示（见SP Martsev，AP Vlasov，P Arosio,等人在《Proterin Engineering》发表的文章，1998，11， 377-381)重组人L和Η铁蛋白在pH2.0到2.8之间时解离成亚基单体。
[0009]其他方面的工作包括使用病毒样颗粒作为疫苗的结构模型，在缺少佐剂的的情况 下诱导产生抗体反应，保护免受病毒感染和过敏反应(见Lechner等人在《Intervirology》 发表的文章，2002,212-217,45(4-6))，但该系统不包括以铁蛋白为基础的蛋白开发系统。 在Marchenko等人在2003年《J.Mol .Microbiol Biotechnol》5(2) :97-104页发表的文章中， 已知蛋白P1-380能够形成病毒样颗粒(VLP)。在该研究中，P1-380蛋白的C端和/或N端融合 后不影响VLP的自组装，具有双功能的融合蛋白颗粒显示出诱导更强免疫反应的能力。 Douglas等人还进行了以下研究:一种形成铁离子核的蛋白与豇豆花叶病毒(CCMV)相连，具 体参考发表在《Adv.Mater.》上的文章，2002,14(6)，415-418页。其他的融合蛋白还有包含 与乳头瘤病毒非结构蛋白L2,一种次要结构蛋白，融合形成的病毒样颗粒的嵌合蛋白，具体 参考Greenstone等人在《PNAS USA》上发表的文章，1998，95(4)，1800-1805页。但是以上所 有的融合蛋白中都不包括铁蛋白。
[0010]因此，以前的文献均未对铁蛋白的使用或分别对颗粒外表面和内表面的N端和C端 的任何用途进行过研究（如图2A和B显示），而且也没有人利用该结构通过与铁蛋白融合连 接其他蛋白或肽以加强这些蛋白或肽的特性，产生能够自组装的的融合蛋白。
[0011] 发明简述
[0012] 因此，本发明的目标是提供包括与铁蛋白N端和/或C端融合的蛋白或肽片段的融 合铁蛋白。
[0013] 本发明的另一目标是除了提供融合铁蛋白，还提供一种表达蛋白的方法，表达蛋 白既可以与颗粒表面结合，也可以通过任一蛋白末端的延伸的内在化表达。
[0014] 本发明的又一目标是提供融合蛋白产品，可应用于疫苗、治疗、图象衬比试剂、新 的金属鳌合系统、胶凝剂、蛋白纯化平台、治疗性受体结合蛋白和其他适当的应用。
[0015] 本发明的再一目标是提供可以在医人和医兽中应用及其他许多非治疗方面中应 用的融合铁蛋白。
[0016] 本发明的另一目标是提供能延长动脉停留时间的融合铁蛋白，这样可以促进免疫 反应的发生，使药物和其他治疗药剂发挥更长时间的治疗作用。
[0017] 本发明的其它目标是提供重组融合铁蛋白在疫苗、药物导入和其他许多治疗方面 的应用，重组融合铁蛋白包括能融合到铁蛋白上的蛋白和肽且不影响蛋白的自组装或形成 高级聚合结构的能力如形成颗粒结构或聚合体的片段。
[0018] 本发明的这些目标及其它目标是提供包含外源蛋白或肽的融合铁蛋白，并能形成 聚合结构如铁蛋白颗粒或其他聚合体，外源蛋白或肽与铁蛋白N或C末端连接。所融合的外 源蛋白或肽不会限制融合蛋白形成具有功能的高级结构如颗粒结构，但也可能形成其他的 聚合结构如半球形，柱状等。依照本发明，融合铁蛋白提供了一种表达蛋白的方法，可以与 铁蛋白外部如颗粒表面连接，或通过蛋白末端延伸融合表达在蛋白内部。本发明的融合蛋 白有多种形式，病毒包膜和衣壳蛋白与铁蛋白融合可以作为病毒疫苗使用。此外因为本发 明的方法还可以融合表达多种蛋白和肽，可以构建多价融合蛋白，如来自同一生物体的不 同蛋白或来自不同生物体的相同蛋白作为多价疫苗。
[0019] 此外，形成铁蛋白颗粒结构时，C端位于铁蛋白内部核心位置，N端位于蛋白外表 面，因此可以构建这样的疫苗:与铁蛋白表面连接的第一种蛋白或肽抗原能快速诱导产生 抗体，而第二种所需抗原与内部C端连接，从而在开始的免疫反应中受到屏蔽达到延长反应 时间的目的。因此该类疫苗的第一部分能诱导产生最初的抗体，疫苗的第二部分只有在经 过一定时间后降解与铁蛋白核心解离暴露第二种抗原才具有免疫原性。这种内部屏蔽作用 为导入非水溶性抗原提供了方法。而且，因为与铁蛋白连接，还能增强融合蛋白或肽在降解 前的有效作用时间，有利于治疗性蛋白或肽发挥作用。本发明中融合蛋白的其他优点还有 当不希望偶联表达的多肽或蛋白引起免疫反应时可以使用人源颗粒(或在兽医中使用动物 来源的颗粒)避免产生免疫相关问题。另一个应用是使用铁蛋白颗粒组装人血红蛋白聚合 体作为运输血液中氧的替代品。最后这类融合蛋白在其他方面也有作用，如清除金属，包裹 有用的蛋白或小分子，或储存与抗体相连、针对特定组织或细胞的具有放射活性的物质。
[0020] 对于读过本说明书和/或引入本文作为参考的此领域的普通技术人员来说，在本 发明的公开范围内的实施方案和其选择方案和修改是显而易见的，所有这样的方案引入本 文作为参考。
[0021] 图示简介
[0022]图1是铁蛋白颗粒的连续剖面图，从四个折叠轴（中心）的角度观察，亚基以醒目的 颜色表示。
[0023]图2A-2B显示铁蛋白颗粒下部四个折叠轴（中心）的1/3图形立体图.清晰标出外部 N端和内部C端，说明可以利用末端构建重组融合蛋白或肽。图2A显示颗粒内部的结构，图2B 显示外表面结构。
[0024]图3为质粒示意图，质粒编码根据本发明构建的人血红蛋白α链与人铁蛋白C端融 合的蛋白。
[0025]图4为在第四个折叠轴周围组装的亚基立体结构图。箭头所示是亚基假定的旋转 方向，通过旋转可容纳较大的C端融合蛋白。
[0026] 图5为(Fl.G.Hq)的正则直方图。
[0027]图6为马心脏天然铁蛋白的正则直方图。
[0028] 图7为(FL.GG.Ag4)的正则直方图。
[0029]图8为(Fl . GG. Ag4)特有颗粒构像的透射电镜图，显示(FL. GG. Ag4)颗粒特有构想 的透射电镜图，M.Stone，et al.未发表结果。
[0030] 图9为质粒示意图，质粒编码根据本发明构建的HIV Tat