一种制备不同铁饱和度乳铁蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质制备领域，具体地说，涉及一种制备不同铁饱和度乳铁蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]乳铁蛋白(lactoferr in，LF)具有广谱抗菌、抗病毒、促进铁吸收、抗癌、调节免疫系统等生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。研究表明，乳铁蛋白主要依赖铁的吸收和释放来发挥多种生理功能，不同铁饱和度的乳铁蛋白，其生理功能有较大差别，比如高铁饱和度的乳铁蛋白补铁效果更好，低铁饱和度的乳铁蛋白抑菌效果则更强。
[0003]随着乳铁蛋白大规模在食品、药品等方面应用，规模化制备不同铁饱和度的乳铁蛋白产品显得越来越重要，目前大多数方法均是在得到乳铁蛋白纯品后，再与铁离子混合获得所需铁饱和度的乳铁蛋白，增加了工艺步骤和制备成本。如中国专利公开号CN102459328A的专利申请，公开了一种具有改进抗微生物活性的低铁乳铁蛋白的制备方法，通过在水性乳铁蛋白提取物中加入醇溶剂与酸溶液得到释放铁离子的乳铁蛋白，而后使用超滤或微滤的方法去除释放的铁、酸和醇，得到10%低铁饱和度的乳铁蛋白产物;美国专利公开号US5606086A的专利申请，公开了具有热稳定性的铁饱和乳铁蛋白的工艺，通过添加碳酸氢盐于铁结合的乳铁蛋白溶液中或加入铁盐与乳铁蛋白溶液于碳酸氢盐溶液中或添加铁盐于含有碳酸氢盐的乳铁蛋白溶液中制成热稳定性较好的乳铁蛋白混合物。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种制备不同铁饱和度的乳铁蛋白的方法。
[0005]为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下:
[0006]—种制备不同铁饱和度乳铁蛋白的方法，所述方法为:分别在含有乳铁蛋白的脱脂乳中加入lmM、3mM和5mM的铁离子溶液，并加入NaHCO3充分混勾，之后分别进行阳离子交换层析，经浓缩脱盐和冷冻干燥后即得不同铁饱和度的乳铁蛋白。
[0007]进一步地，所述的铁离子溶液为FeCl3.6H2O溶液或FeSO4.7出0溶液或(NH4)2Fe(SO4)2.6H20溶液。
[0008]进一步地，加入NaHCO3后，所述NaHCO3在整个体系中的浓度为10mM?200mM。
[0009]进一步地，所述阳离子交换层析具体为:将混匀后的溶液上样到阳离子交换层析柱，使用pH6.5?7.5,3ms/cm的磷酸盐缓冲液冲洗层析柱，而后用pH6.5?7.5，45ms/cm的磷酸盐-氯化钠缓冲液将杂蛋白洗脱下来，最后使用pH6.5?7.5，60?85ms/cm的磷酸盐-氯化钠缓冲液洗脱重组人乳铁蛋白溶液。
[0010]更进一步地，所述阳离子交换层析具体为:将混匀后的溶液上样到用3mS/cm，pH6.5?7.5磷酸盐缓冲液平衡的阳离子交换层析柱，流速为22cm/h，上样完毕后，使用pH6.5?7.5，3ms/cm的磷酸盐缓冲液冲洗层析柱，而后用pH6.5?7.5，45ms/cm的磷酸盐_氯化钠缓冲液将杂蛋白洗脱下来，最后使用PH6.5?7.5，60?85ms/cm的磷酸盐-氯化钠缓冲液洗脱乳铁蛋白溶液。
[0011]进一步地，所述浓缩脱盐是将乳铁蛋白洗脱液置入AKTACross flow的储液罐中，使用10?30kD的超滤膜，流速为40ml/min，转膜压为Ibar对乳铁蛋白溶液浓缩脱盐。
[0012]进一步地，所述冷冻干燥是将乳铁蛋白浓缩液在超净台中进行无菌过滤后放入冷冻干燥机的隔板中，步骤如下:温度设为_40°C、压强为300mTor预冻4h;冻干隔板温度设为30°C，压强设为300mTor —次冻干20?35h。
[0013]进一步地，所述乳铁蛋白的铁饱和度为25 %?96 %。
[0014]本发明的有益效果在于:
[0015]本发明提供了一种通过层析分离技术制备不同铁饱和的乳铁蛋白，可以满足乳铁蛋白产品的不同需求，此工艺操作简单、成本低廉，可大规模制备不同铁饱和度的乳铁蛋白纯品。
【附图说明】
[0016]图1为本发明实施例1?3中所述不同铁饱和重组人乳铁蛋白阳离子交换色谱图。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0018]实施例中所用的主要试剂如下:
[0019]FeCl3.6H20、FeS04.TH2O^(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O^Na2HPO4.12H20^NaH2P04.2H20、NaOH购自西陇化工股份有限公司;NaHC03、95%乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；天然人乳铁蛋白购自Sigma公司。
[0020]所用的主要仪器如下:
[0021 ] AKTAexplorer 100快速蛋白液相层析系统、SP Sepharose Big Beads填料、AKTACross flow均购自GE Healthcare;TSK gel SuperSW3000色谱柱，购自安捷伦科技有限公司；陶瓷膜冷除菌及超滤凭介装置(型号T0P/CMM-1/3/3T)、1.4μπι陶瓷膜购自陶普森公司；Pellicon XL Filter PXB030A 30 kD购自Millipore公司；真空冷冻干燥机购自Millrock;SpectraMax Plus 384连续光谱扫描式酶标仪，购自美谷分子仪器公司。
[0022]实施例1低铁饱和度的乳铁蛋白制备方法
[0023]1、牛乳预处理
[0024]按照上述工艺方法将含有乳铁蛋白的哺乳动物乳样进行预处理，乳铁蛋白可是人乳铁蛋白，也可以是牛的乳铁蛋白或其它哺乳动物来源的乳铁蛋白，本实施例优选含重组人乳铁蛋白的牛乳。将乳样加热至35°C后通过碟式离心脱脂机进行乳脂去除，去除率293%，然后利用0.2μπι?1.4μπι陶瓷膜技术进行牛乳中细菌及残留乳脂的去除，其去除率299 %。将操作温度设为40°C，进口压为0.3Mpa?0.5Mpa，而后打开透过阀门，将操作压设置为0.1Mpa?0.3Mpa，流速为6m/s，通量为100L.m2/h?500L.m2/h，便可得到纯净的脱脂乳。
[0025]2、阳离子交换层析
[0026]将上一步骤获得的脱脂乳加入10mM NaHCO3缓冲液与ImMFeCl3.6H20溶液，充分混勾30min,上样到用3ms/cm，pH 6.5磷酸盐缓冲液平衡的SP Sepharose Big Beads阳离子交换层析柱，流速为22cm/h，上样完毕后，使用3ms/cm，pH 6.5磷酸盐缓冲液冲洗层析柱，而后用pH6.5，45ms/cm的磷酸盐-氯化钠缓冲液将杂蛋白洗脱下来，最后使用pH 6.5，85ms/cm的磷酸盐-氯化钠缓冲液洗脱重组人乳铁蛋白溶液(图1)。
[0027]3、浓缩脱盐
[0028]将上一步骤获得的乳铁蛋白洗脱液置入AKTACrossflow的储液罐中，使用30kD的超滤膜，流速为40ml/min，转膜压为Ibar开始对乳铁蛋白溶液浓缩脱盐。
[0029]4、冷冻干燥
[0030]将上一步骤获得的乳铁蛋白浓缩液在超净台中进行无菌过滤后放入冷冻干燥机的隔板中，步骤如下:温度设为_40°C、压强为300mTor预冻4h;冻干隔板温度设为30°C，压强设为300mTor—次冻干20?35h，即可得到含有一定铁饱和度的重组人乳铁蛋白粉。利用原子发射光谱与RP-HPLC对其分别进行铁含量的检测、蛋白收率与纯度的检测，测得铁饱和度30.6% ±4%、纯度为90.3% ±0.2%，蛋白收率为87.7% ±2.5%。
[0031]实施例2中铁饱和度的乳铁蛋白制备方法