一种体外皮肤模型及角质形成细胞长效培养液的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域，涉及一种体外皮肤模型及角质形成细胞长效培养液。
【背景技术】
[0002]体外皮肤模型是应用组织工程技术在体外通过对种子细胞的条件化培养而构建而成的一块皮肤组织，该组织与人体皮肤在组织结构及部分生物学功能上有着高度的相似性，因此被广泛应用于化妆品、药品等产品及原料的功效性和安全性评价、检测。目前常见的体外皮肤模型有:表皮模型，含真皮层、表皮层的全层皮肤模型，含有黑色素细胞的表皮模型等。
[0003]市售的体外皮肤模型在构建完成后，直接保存在构建培养液中，其宣传的使用期限多以3天为主，但都推荐在模型构建完成后24小时内使用，因为皮肤模型为活细胞产品，会持续生长、分化，长时间的增殖分化必然会改变皮肤模型的结构及生物学功能，从而导致测试结果不准确；另外，根据某些测试目的的不同，需要延长模型的培养、处理时间，仍难以避免出现上述问题。构建培养液的培养体系仅能支持皮肤模型正常生发，但无法满足构建完成后的皮肤模型维持结构及生物学特性，因此开发一种可以用于体外皮肤模型培养、保存用的培养液意义重大。
[0004]角质形成细胞是表皮中的主要细胞，具有干细胞特性，能在不同培养条件刺激下分化成表皮基底层细胞、棘层细胞、颗粒层细胞及角质层细胞，形成与正常表皮结构高度一致的四层结构。一般体外皮肤模型构建成功后的测试培养周期不超过3天就会出现活力下降及组织过度分化的现象。正常分离出来的角质形成细胞多采用K-SFM培养液进行培养，在体外扩增传代不超过10代就会出现老化，甚至死亡的现象，尤其是在含血清的培养体系中，其老化死亡速度更快。
[0005]为延缓或重新恢复角质形成细胞的增殖、分化能力，保证体外皮肤模型结构及活力满足测试要求，唯有通过表皮细胞的去分化技术。一类是通过转基因技术给已分化细胞通过病毒转染体系转入oct4，sox2，C-Myc及klf4 4种基因，经过体外诱导使终末分化细胞重新具有干细胞特性，即诱导多功能干细胞(iPS Cell);另一类是通过非转基因技术，通过核移植、体细胞克隆，过氧化氢处理及热刺激等方法使细胞去分化。但上述方法仅限于理论研究，技术难度较大，会导致成本倍增，不利于产业化操作，而且处理方法会对构建的模型产生损伤，造成模型测试结果的不准确。
[0006]针对以上问题，学者们通过研究发现，改变表皮细胞所处的微环境，有可能使已分化细胞去分化而逆转成表皮干细胞，例如，通过给培养液中添加表皮细胞生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(β-FGF)，转化生长因子(TGF)等多种因子，可以使分化的表皮细胞重新呈现干细胞特性。添加干细胞及肿瘤细胞提取液也能起到相似的作用。
[0007]通过上述处理，虽然能够使已经发生分化的细胞重新呈现分化前的状态，同时对老化及损伤的细胞的也有一定的复壮作用，从而保证体外皮肤模型继续保持一定的增殖分化能力，但是在正常的培养液中，模型也会保持正常的生长速度，甚至更快，所以单纯添加上述因子或含有上述因子的混合物并不能实现延长模型培养期限的目的，无法平衡增殖与分化之间的速度。
[0008]研究表明甘醇酸有促进表皮细胞增殖，溶解角质层，抑止表皮细胞过度分化，逆转早期肿瘤细胞恶性等作用。研究表明低剂量I X 10—7M维甲酸可以显著降低如Kl，K10，K11等与表皮细胞分化有关的角蛋白的表达，能从一定程度上控制皮肤的过度分化，平衡增殖分化速度。
[0009]中国专利200810169475.8中提到通过改变热刺激条件和生长因子干预的方法可使表皮细胞去分化转变为表皮干细胞。该方法需对表皮细胞热激处理后，然后在生长因子的作用下，继续孵育培养7?14天，首先前期处理时间过长，对于体外皮肤模型的生产周期及成本会显著增加;其次干细胞构建后期数量会急剧减少而得不到补充，不能从根本解决构建后期模型活力降低及过度分化的问题。
[0010]中国专利200910078302.X及201010196382.1中均提及，体外皮肤模型培养液系统仅限于皮肤模型的构建培养，用此类培养基，可保证体外皮肤模型生发成正常的结构，对于保存期间及正常使用期间的结构变化不能有效控制，而在此期间发生的模型屏障功能及其他精细结构的变化对模型测试结果的准确性又有很大的影响;对于需要长期培养、处理的体外皮肤模型，应用上述培养体系将会因组织活力下降、组织结构严重变化而无法实现。
[0011]目前还未见有一种培养液能够支持含有表皮细胞的体外皮肤模型长效培养，因此本发明对延长体外皮肤模型应用时间，拓宽体外皮肤模型应用领域，以及表皮细胞相关疾病研究等方面有重要的意义。
【发明内容】
[0012]本发明目的在于，主要针对体外皮肤模型在体外长效培养过程中，会出现活力下降及过度分化而导致无法应用于测试的问题，本发明在体外皮肤模型基础培养液的基础上，通过胚胎干细胞培养液提取物与甘醇酸的协同作用，提供一种可用于体外皮肤模型及角质形成细胞长效培养的培养液。
[0013]本发明目的主要通过以下技术方案来实现:一种体外皮肤模型及角质形成细胞长效培养用培养液，组分包括基础培养液，添加了胚胎干细胞培养液提取物和甘醇酸。
[0014]所述基础培养液是K-SFM或M⑶Β153或体积比为I: 3的F12和DMEM混合培养液，其中添加了 5~50yg/ml 的BPE，5?50ng/ml的EGF，l~20yg/ml的膜岛素，0.01?0.0.Smmol /ml 的CaCl2o
[0015]所述胚胎干细胞培养液提取物的浓度为0.01?30mg/ml;
所述甘醇酸的浓度为I X 10—9?I X 10—5mol/L;
一种体外皮肤模型及角质形成细胞长效培养液的配制方法如下:
在K-SFM、MCDB153、体积比为I: 3混合的F12和DMEM三种培养液中的任意一种中，依次添加终浓度为5?50yg/ml的BPE，5?50ng/ml 的EGF，I?20yg/ml的膜岛素，0.01?0.05mmol/ml的CaCl2，制备完成基础培养;将胚胎干细胞培养液提取物按照终浓度为0.01?30mg/ml添加到基础培养液中，然后添加甘醇酸，终浓度I X 10—9?I X 10—5mol/L，混合均匀后用0.22μπι的滤膜过滤除菌后即可用于体外皮肤模型的长效培养或者角质形成细胞的培养。
[0016]体外皮肤模型及角质形成细胞长效培养液的使用方法: 将构建培养成功后的体外皮肤模型中的培养液弃去，加入长效培养液继续进行气液面培养，每24小时换液I次，可以连续培养7天。在此期间可随时终止培养，根据检测要求直接进行后续检测操作。
[0017]将消化好的原代角质形成细胞或传代的角质形成细胞，直接采用长效培养液进行培养，每24小时换液一次，扩增至第十二代，期间可根据检测及研究需要直接使用。
[0018]本发明中的基础培养液含有体外皮肤模型培养所需基本物质，可以保证体外皮肤模型正常生长。所使用的胚胎干细胞培养液提取物中，含有各种细胞因子，且经过超滤浓缩处理后，有效因子及活性成分的含量得到了富集，这些因子及活性成分对于维持干细胞微环境，细胞损伤修复，以及促使分化细胞重新获得分化能力上有极大的作用。其中干细胞生长因子(SCGF)对于激活和维持干细胞增殖、分化能力，碱性成纤维生长因子(β-FGF)可促进内皮样细胞增殖，同时对损伤细胞有较好的修复作用。转化生长因子(TGF)对于细胞是一多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长、分化、细胞凋亡及免疫调节等功能，转化生长因子-1KTGF-β)是TGF家族的一员，可以通过SMAD信号通路和/或DAXX信号通路发挥其生物学功能。除上述因子外，干细胞培养液提取物中还含有其他各种细胞生长因子如表皮生长因子(EGF)，神经生长因子(NGF)，肝细胞生长因子(HGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，血小板源性生长因子(PDGF)，血管内皮生长因子(VEGF)等，这些都是干细胞生长必不可少的因子，对于维持干细胞生长环境有重要的作用。通过上述因子的作用，激活与细胞增殖、分化调节有关的最主要的MAPK通路，延缓或逆转细胞老化状态，同时也可以修复细胞损伤，提高细胞增殖、分化活力。
[0019]研究表明，甘醇酸除了对表皮有去角质、抗增殖作用。其最基本的作用可能是在与组织蛋白质结合后转移到细胞核内，调控基因的表达，从而调节角质生成细胞的分化过程。
[0020]本发明通过胚胎干细胞培养液提取物及甘醇酸两者的协同作用，保证了体外皮肤模型在体外长效培养过程中的组织活力及结构完整，从而保证正常的模型生物学功能。其中胚胎干细胞培养液提取物中含有细胞生长及去分化的各种因子，如TGF、EGF、FGF、SCGF等，这些因子可以有效提高组织内细胞活性，修复损伤细胞，延缓或逆转已分化细胞状态，增加组织内活细胞及有增殖分化能力细胞的数量，从而为正常组织的培养时间的延长提供基础；同时为了保证组织不会因为活力增强而随培养时间增长出现过度增殖的现象，添加一定量的甘醇酸，通过其对表皮细胞增殖分化的抑制作用及对角质层的溶解作用，达到增殖与分化的完美平衡，从而实现延长体外皮肤模型的体外培养时间，为后期测试及相关研究提供可靠地条件支持。
[0021 ]目前还未见将胚胎干细胞培养液提取物及甘醇酸用于体外皮肤模型及角质细胞培养相关报道，因此，本专利组合应用以上两种物质，开发一种新型长效培养液，该培养液能有效的平衡体外皮肤模型及角质形成细胞增殖及分化速度，能延长体外皮肤模型构建成功后的有效检测时间，从常规3天有效检测时间延长至7天，同时可提升常规3天有效期内模型质量，提高检测结果的准确性，极大的满足不同检测条件的时间要求，拓展体外皮肤模型应用