2倍，RNA之间可W看到很淡的雾蒙蒙的拖带（150V电压，15min)(参照图1)。
[0059] 基因克隆及载体构建：
[0060] 利用Primer Premier 5.0软件设计E；nd to End特异引物。根据CsMyb基因完整ORF 序列信息，设计特异引物，W茶树cDNA为模板，利用Hi曲-Fidelity DNA Polymerase扩增目 的基因。将切胶回收的目的基因连接至PMD19-T Simple Vector上，交由上海英俊科技股份 有限公司完成测序工作。
[0061 ] (1)根据Gateway克隆技术说明，设计特异引物时，将attBl接头序列加至CSMYB6A 基因上游引物的5/端，将attB2接头序列加至CSMYB6A基因下游引物的5/端。
[0062] (2)W测序正确的带有CSMYB6A基因的质粒为模板进行高保真PCR，回收带有attB 接头序列的目的基因产物。
[0063] (3)进行BP反应，反应体系：pD0NR207Vector，75ng;回收产物，25~50ng;BP Clonase? enzyme mix，0.化1^;加水补至扣Le25°C水浴化后转化至Trans-Tl感受态，涂布含 有庆大霉素(50mg/L)的LB固体培养基上。
[0064] (4)测序正确后提取质粒进行LR反应，反应体系：pGWB5Vector，75ng; PD0NR207- CsMYB6A，25~50ng;LR Clonase? en巧me 1111义，0.扣1^;加水补至扣Le25°C水浴化后转化至 化ans-Tl感受态，涂布含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上。
[0065] (5)测序正确后抽提质粒pGWB5-CsMYB6A-GFP，然后利用电转法将该载体转入根癌 农杆菌EHA105(购自上海北诺生物科技有限公司，货号：邸5012B)，在含有壮观霉素（50mg/ L)和卡那霉素（50mg/L)的LB固体培养基上进行筛选，28°C倒置培养4她。利用菌落PCR鉴定 阳性克隆。（参照图2)
[0066] 转基因烟草的培育：
[0067] (1)取25ml含大观霉素和卡那霉素的LB液体培养基，接入1ml活化后的含有目的基 因的农杆菌EHA105-pCB2004-CsMYB6A，28°C摇至菌液浑浊，0D值在0.6左右。
[006引（2)4°C，5000r/s 离屯、20min。
[0069] (3)弃上清，加入30ml含AS(19.6mg/L)的1/2MS。将沉淀揽起混匀，4°C，5000r/s离 屯、20min。
[0070] (4)弃上清，再次加入含AS的1/2MS溶液，调0D值至0.6。
[0071] (5)将预培养好的叶片丢进菌液侵染15min，期间戳破叶片，W利于农杆菌通过伤 口进入叶片基因组。之后将叶片放于铺有滤纸的平皿中，干燥。
[0072] (6)将干燥后的小叶片平铺在共培养基上，暗培养3天。
[0073] (7)共培养完成后取出叶片，用400mg/L簇节青霉素冲洗叶片表面菌体，反复清洗 Ξ次，最后用无菌水冲洗，吸干表面水分，置于含有草锭麟(25mg/L)的生芽培养基中诱导芽 的分化。期间持续用200mg/L簇节青霉素和头抱嚷目亏(400mg/L)交替使用脱菌。
[0074] (8)反复脱菌直至芽长出（约3个月），取芽置于含有草锭麟(25mg/L)的生根培养基 中诱导生根。
[0075] (9)待生根后(约1个月），移栽壮苗。
[0076] (10)对转基因的烟草小苗提DNA进行PCR验证。
[0077] 烟草转基因前后的对比可参考图3。
[0078] 花青素的提取及检测：
[0079] (1)取新鲜植物叶片或干材料，擦净组织表面污物，剪碎混匀。
[0080] (2)称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研鉢中，加入液氮磨成粉末。加入 少量石英砂和碳酸巧粉及80 %盐酸甲醇2~3ml，研磨成匀浆，用移液枪将研鉢液移至离屯、 管中。
[0081] (3)再加入80%盐酸甲醇2~3ml两Ξ次，充分清洗研鉢里的组织液，至离屯、管中， 组织液终体积为10ml。
[0082] (4)充分震荡离屯、管中的组织液，500化pmaOmin离屯、。取上清至新的离屯、管中。
[0083] (5) 12000巧m，10min离屯、，取上清至新的离屯、管中。
[0084] (6)在530nm下液相检测。
[00财 HPLC分析：美国waters 600E高效液相色谱仪；色谱柱为菲罗口系列色谱柱4u Rision-RP80(粒径:5皿，柱长:250mm，内径:4.6mm)，流速1.0血min-i，柱溫箱25°C。流动相 为1%乙酸(A相），100%乙腊(B相）；烟草提取物的线性洗脱梯度为:30min内B相从13到30% (v/v)，32min回到13%。040检测器设53011111，对花青素进行实时的监测。（参照图4)
[0086]上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的 人±能够了解本
【发明内容】
并加 W实施，并不能W此限制本发明的保护范围。凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法，其特征在于，步骤包 括： (1) 设计特异引物 CsMYB6A-F：ATGGACATTGTTTGTTGT； CsMYB6A-R：TCATTCATCACCTAACAGATCCC； CsMYB6A-attb-F： GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGACATTGTTTGTTGT； CsMYB6A-attb-R： GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATTCATCACCTAACAGATCCC； 以茶树cDNA为模板，将attBl接头序列加至CsMYB6A基因上游引物的5'端，将attB2接头 序列加至CsMYB6A基因下游引物的5'端； (2) 以测序正确的带有CsMYB6A基因的质粒为模板进行高保真PCR，回收带有attB接头 序列的目的基因广物； (3) 进行BP反应，水浴后转化至Trans-Tl感受态，涂布含有庆大霉素的LB固体培养基 上； (4) 测序正确后提取质粒进彳TLR反应； (5) 测序正确后抽提质粒pGWB5-CsMYB6A-GFP，然后利用电转法将该载体转入根癌农杆 菌EHA105,在含有壮观霉素和卡那霉素的LB固体培养基上进行筛选，倒置培养，利用菌落 PCR鉴定阳性克隆。2. 根据权利要求1所述的紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法，其特 征在于，（3)BP反应的体系为：pD0NR207 Vector，75ng;回收产物，25~50ng;BP Clonase? enzyme mix，0·5μL;方口水补至5μL。3. 根据权利要求1所述的紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法，其特 征在于，（4)LR反应的体系为：pGWB5 Vector，75ng;pD0NR207-CsMYB6A，25~50ng;LR Clonase? enzyme mix，0·5yL;加水补至5μΙ^25"?水浴3h后转化至Trans-Tl感受态，涂布含 有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上。4. 根据权利要求1所述的紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法，其特 征在于，茶树cDNA，其提取的步骤包括： (1) 茶叶组织加等量的PVPP，用液氮研磨至细粉末； (2) 将上述粉末用枪头转移至离心管中，加入Fruit-mate for RNA purification，用 枪头搅拌使粉末与溶液充分混合，裂解18-22min，待裂解液呈透明状，12000g，4°C离心 5min； (3) 吸取上清液，平均分至2个离心管中，分别加入等体积的RNAiso Plus，盖紧离心管 盖，用力震荡，待溶液充分乳化后，室温静置5min; (4) 分别加入1/5总体积量的氯仿，用力震荡混匀，室温静置5min，12000g 4°C离心 15min； (5) 吸取上清转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置 10min，12000g 4°C离心10min; (6) 弃上清，缓慢沿离心管壁加入lml 75%乙醇，轻弹后，12000g 4°C离心5min，弃上清 保留沉淀，重复(6)至少3次； (7) 弃上清保留沉淀后，吸取多余的乙醇，真空干燥，加适量RNase-Free水，用RNase-Free枪头轻轻吹打沉淀，放在-80°C保存； (8) 用核酸定量仪检测提取的总RNA的含量和质量。5. -种紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆的应用方法，其特征在于，步骤包括： (1) 取25ml含大观霉素和卡那霉素的LB液体培养基，接入lml活化后的含有目的基因的 农杆菌EHA105-pCB2004-CsMYB6A，28°C摇至菌液浑浊，0D值在0.6左右； (2) 4°C，5000r/s离心20min; (3) 弃上清，加入30ml含19.6mg/L的AS的1/2MS，将沉淀搅起混匀，4°C，5000r/s离心 20min； (4) 弃上清，再次加入含AS的1/2MS溶液，调OD值至0.6; (5) 将预培养好的叶片丢进菌液侵染15min，期间戳破叶片，以利于农杆菌通过伤口进 入叶片基因组。之后将叶片放于铺有滤纸的平皿中，干燥； (6) 将干燥后的小叶片平铺在共培养基上，暗培养3天； (7) 共培养完成后取出叶片，用400mg/L羧苄青霉素冲洗叶片表面菌体，反复清洗三次， 最后用无菌水冲洗，吸干表面水分，置于含有25mg/L草铵膦的生芽培养基中诱导芽的分化， 期间持续用200mg/L羧苄青霉素和400mg/L头孢噻肟交替使用脱菌； (8) 反复脱菌直至芽长出，取芽置于含有25mg/L草铵膦的生根培养基中诱导生根； (9) 待生根后，移栽壮苗； (10) 对转基因的烟草小苗提DNA进行PCR验证。
【专利摘要】本发明公开了一种紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法以及应用，具体涉及一种紫芽茶树DNA片段的分离、克隆、功能验证及应用，该基因调控花青素合成，能够改变植物叶片的颜色，提高植物花青色的含量，将该基因转化到烟草中，能使转基因烟草叶片变红，花青素含量明显增加。
【IPC分类】A01H4/00, A01H5/00, C12N15/84, C12N15/29
【公开号】CN105671059
【申请号】CN201610225282
【发明人】王云生, 何秀娟, 王新珍, 夏涛, 高丽萍
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月11日