31]实施例2
[0032]培养基配方(质量百分比):蚕蛹粉0.5%，蛋白胨1.5%，酵母粉1%，葡萄糖3%，无水硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.1%,七水硫酸锌0.0013 %，天门冬氨酸0.1%,维生素C0.1%，纯牛奶8%。
[0033]收集野生新鲜冬虫夏草子囊孢子，通过体视镜挑取单子囊孢子进行培养，经过纯化培养之后获得中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面;选取长势良好的中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面，并挑取数块0.5cm2左右大小的菌块接种于能获得大量菌丝体的培养基中，用无菌勾楽器将菌块均勾打碎，于120rpm，20°C恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶，将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶，以此类推，将获得的三级摇瓶在洁净区进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣;将菌渣分装于500ml无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，装量约为广口瓶体积的二分之一，用纱布以及封口膜封好瓶盖，放置于温度为20 0C、湿度为70 %的培养箱中生长;15天后，菌渣表面完全生长透彻，布满气生菌丝，再在温度为10°C、湿度为90%的条件下，蓝光培养12小时，黑暗培养12小时，诱导分生孢子，诱导20天后即可得到大量散落的中国被毛孢肾形分生孢子。
[0034]经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢子总数为111数量级。
[0035]实施例3
[0036]培养基配方(质量百分比):蚕蛹粉0.5%，蛋白胨1%，酵母粉2%，葡萄糖2%，无水硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，七水硫酸锌0.0013%，天门冬氨酸0.1%，维生素C0.1%，纯牛奶8%。
[0037]收集野生新鲜冬虫夏草子囊孢子，通过体视镜挑取单子囊孢子进行培养，经过纯化培养之后获得中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面;选取长势良好的中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面，并挑取数块0.5cm2左右大小的菌块接种于能获得大量菌丝体的培养基中，用无菌勾楽器将菌块均勾打碎，于120rpm，20°C恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶，将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶，以此类推，将获得的三级摇瓶在洁净区进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣;将菌渣分装于500ml无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，装量约为广口瓶体积的二分之一，用纱布以及封口膜封好瓶盖，放置于温度为18°C、湿度为70%的培养箱中生长;20天后，菌渣表面完全生长透彻，布满气生菌丝，再在温度为8°C、湿度为80%的条件下，蓝光和红光同时照射培养12小时，黑暗培养12小时，诱导分生孢子，诱导10天后即可得到大量散落的中国被毛孢肾形分生孢子。
[0038]经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子(图2)，统计结果中分生孢子总数为112数量级。
[0039]实施例4
[0040]培养基配方(质量百分比):蚕蛹粉0.5%，蛋白胨1.5%，酵母粉1.5%，葡萄糖4%，无水硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1 %，七水硫酸锌0.0013%，天门冬氨酸0.1 %，维生素C
0.1%，纯牛奶8%。
[0041]收集野生新鲜冬虫夏草子囊孢子，通过体视镜挑取单子囊孢子进行培养，经过纯化培养之后获得中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面;选取长势良好的中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面，并挑取数块0.5cm2左右大小的菌块接种于能获得大量菌丝体的培养基中，用无菌勾楽器将菌块均勾打碎，于120rpm，20°C恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶，将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶，以此类推，将获得的三级摇瓶在洁净区进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣;将菌渣分装于500ml无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，装量约为广口瓶体积的二分之一，用纱布以及封口膜封好瓶盖，放置于温度为20 0C、湿度为80 %的培养箱中生长；15天后，菌渣表面完全生长透彻，布满气生菌丝，再在温度为5°C、湿度为70%的条件下，蓝光和红光同时照射培养12小时，黑暗培养12小时，诱导分生孢子，诱导15天后即可得到大量散落的中国被毛孢肾形分生孢子。
[0042]经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢子总数为112数量级。
[0043]实施例5
[0044]培养基配方(质量百分比):蚕蛹粉0.5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1.5%，葡萄糖2%，无水硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1 %，七水硫酸锌0.0013%，天门冬氨酸0.1 %，维生素C
0.1%，纯牛奶8%。
[0045]收集野生新鲜冬虫夏草子囊孢子，通过体视镜挑取单子囊孢子进行培养，经过纯化培养之后获得中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面;选取长势良好的中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面，并挑取数块0.5cm2左右大小的菌块接种于能获得大量菌丝体的培养基中，用无菌勾楽器将菌块均勾打碎，于120rpm，18°C恒温摇床中培养15天，记为一级摇瓶，将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶，以此类推，将获得的三级摇瓶在洁净区进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣;将菌渣分装于500ml无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，装量约为广口瓶体积的二分之一，用纱布以及封口膜封好瓶盖，放置于温度为20 0C、湿度为70 %的培养箱中生长;15天后，菌渣表面完全生长透彻，布满气生菌丝，再在温度为10°C、湿度为90%的条件下，蓝光和红光同时照射培养12小时，黑暗培养12小时，诱导分生孢子，诱导10天后即可得到大量散落的中国被毛孢肾形分生孢子。
[0046]经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢子总数为112数量级。
【主权项】
1.一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，其特征在于，包括以下制备步骤: (1)菌种选择:收集冬虫夏草子囊孢子，挑取单子囊孢子进行培养，得到中国被毛孢单子囊孢子菌落； (2)菌渣获得:在菌落中挑取3-5块菌块接种于培养基中，将菌块打碎，于恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶;将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶；将二级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为三级摇瓶;将获得的三级摇瓶进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣； (3)菌渣生长:将菌渣分装于无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，封好瓶盖，放置于恒温培养箱中培养生长； (4)分生孢子诱导:待菌渣表面布满气生菌丝后，在一定温湿度下光周期刺激培养进行分生孢子诱导，诱导一定时间后得到大量散落的分生孢子； 所述光周期刺激培养为光照培养12小时，黑暗培养12小时；其中，光照的光源选自蓝光、红光、或蓝光与红光的组合。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述培养基的配方，由以下质量百分比的组分组成:蚕蛹粉0.5 %，蛋白胨0.5-1.5 %，酵母粉1-2 葡萄糖2-4 %，无水硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.1%,七水硫酸锌0.0013 %，天门冬氨酸0.1%,维生素C 0.1 %，纯牛奶8% ο3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述菌块打碎后在摇床中的培养条件为:在120rpm下，20 °C恒温培养。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述菌渣生长阶段的温度为15-20Γ。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述菌渣生长阶段的湿度为60-80%。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述分生孢子诱导阶段的温度为5-10。。。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述分生孢子诱导阶段的湿度为70-90%。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述菌渣的生长时间为15-25天。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述分生孢子的诱导时间为10-20天。
【专利摘要】本发明公开一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，该方法包括菌种选择、菌渣获得、菌渣生长和分生孢子诱导四个步骤。本发明所述方法中选用稳定性好、活力强、发酵出来的菌丝体量多的冬虫夏草单子囊孢子作为菌种，通过对菌丝多级扩培，并在分生孢子诱导阶段选用不同的光源进行光周期刺激培养，在短周期内便可获得高产量的中国被毛孢分生孢子(1011～1012)，对人工培植冬虫夏草的产业化发展有重要意义。
【IPC分类】C12N3/00, C12R1/645
【公开号】CN105695390
【申请号】CN201610196300
【发明人】李文佳, 张宗耀, 李全平, 吕延华, 何俊
【申请人】广东东阳光药业有限公司, 宜昌山城水都冬虫夏草有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年3月31日