本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/精子数目的值 即可。
[0031] 实施例2 一种体外获能后精子质量评估的方法，具体步骤如下： A、 精子的洗涂 收集新鲜液化精液标本，用憐酸缓冲液或者BWW培养液洗涂精子，充分除去残留的精浆 成分，再离屯、分离出精子. B、 精子的体外获能 向A步骤分离出的精子中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的C〇2细胞培养箱中培养， 收获上游精子，计数精子数量，用体外获能液在5%的C〇2细胞培养箱中解育精子4 h;离屯、分 离，收取的上清液再次离屯、分离，收取上清液作为待测样本； C、 精子获能液中唾液酸酶活性的测定 (1)用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯 度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本。
[0032] (2)用检测缓冲液稀释巧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本 的孔内，再将检测板置于37°C，避光解育2小时后，用酶标仪在激发波长和发射波长分别为 365nm和450nm的波长下读取各孔巧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的 唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/精子数目的值即可。
[0033] 实施例3 一种体外获能后精子质量评估的方法，具体步骤如下： A、 精子的洗涂 收集新鲜液化精液标本，用憐酸缓冲液或者BWW培养液洗涂精子，充分除去残留的精浆 成分，再离屯、分离出精子. B、 精子的体外获能 向A步骤分离出的精子中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的C〇2细胞培养箱中培养， 收获上游精子，计数精子数量，用体外获能液在5%的C〇2细胞培养箱中解育精子3.5 h;离屯、 分离，收取的上清液再次离屯、分离，收取上清液作为待测样本； C、 精子获能液中唾液酸酶活性的测定 (1)用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯 度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本。
[0034] (2)用检测缓冲液稀释至巧光试剂的浓度为0.05mM，将其加入上述各唾液酸酶标 准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37°C，避光解育1.5小时后，用酶标仪在激发波 长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔巧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲 线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/精子数目的值即可。
[0035] 实施例4 本实施例在实施例1的基础上： 所述的检测板为96孔黑板。
[0036] 实施例5 本实施例在实施例1的基础上： 所述的检测板为96孔黑板。
[0037] 所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/1乙酸钢和0.25iig/山牛血清白蛋白的憐酸缓 冲液。
[003引实施例6 本实施例在实施例2的基础上： 所述的检测板为96孔黑板。
[0039] 所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/1乙酸钢和0.25yg/山牛血清白蛋白的憐酸缓 冲液。
[0040] 所述乙酸钢的抑值为5。
[0041 ] 实施例7 本实施例在实施例2的基础上： 所述的检测板为96孔黑板。
[0042] 所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/1乙酸钢和0.25yg/山牛血清白蛋白的憐酸缓 冲液。
[0043] 所述乙酸钢的pH值为6。
[0044] 所述的体外获能液为含服A 5mg/ml的HTF。
[0045] 实施例8 本实施例在实施例3的基础上： 所述的检测板为96孔黑板。
[0046] 所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/1乙酸钢和0.25yg/山牛血清白蛋白的憐酸缓 冲液。
[0047] 所述乙酸钢的pH值为5.5。
[004引所述的体外获能液为含服A 5mg/ml的HTF。
[0049]所述的唾液酸酶标准原液为产气芙膜梭菌唾液酸酶，浓度为抓/ml。
[00加]实施例9 本实施例在实施例3的基础上： 所述的检测板为96孔黑板。
[0051]所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/1乙酸钢和0.25yg/山牛血清白蛋白的憐酸缓 冲液。
[0化2] 所述乙酸钢的pH值为5。
[0053] 所述的体外获能液为含服A 5mg/ml的HTF。
[0054] 所述的唾液酸酶标准原液为产气芙膜梭菌唾液酸酶，浓度为抓/ml。
[0055] 所述的巧光试剂是y-4-甲基伞形酬基-a-D-N-乙酷神经氨酸钢。
[0化6] 实施例10 耗材(均灭菌）：ISndEP管，1.5m化P管，3种规格枪头（lml/200山/10山），96孔透明板，96 孔黑板 仪器:高速低溫离屯、机，酶标仪 一种体外获能后精子质量评估的方法，具体步骤如下： A、精子的洗涂 1. 收集新鲜液化精液标本4-5ml (根据病人精子数量调整，冰上保存与运输）. 2. 加入等体积PBS，吹打均匀。
[0化7] 3.低速离屯、（1500g/5min)，弃去上清液。
[0化引 4.加入PBS至3-4ml，吹打均匀。
[0化9] 5.低速离屯、（1500g/5min)，弃去上清液，将上清液剩至30化1左右，吹打均匀。
[0060] 6.加入PBS至1ml，高速离屯、(4度，12000巧m/5min)，尽可能弃去上清液。
[0061] B、精子的体外获能 1.向精子沉淀中加入BWW，上游法于37°C5%C02细胞培养箱中培养30min，收获上游精 子，计数精子数量(需IXlO7W上），低速离屯、（1500g/5min)，得到精子沉淀。
[0062] 2.加入体外获能液，于37°C 5%C02细胞培养箱中解育4小时。
[0063] 3.低速离屯、巧00g/5min)，收取上清液。
[0064] 4.再低速离屯、巧OOOgA5min)，收取上清液。
[0065] C.精子获能液中唾液酸酶活性的测定 1.用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯 度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向96孔检测板(黑色）内依次加入50山各唾液酸酶标准溶 液。
[0066] 2.用用检测缓冲液稀释至巧光试剂的浓度为0.05mM，将其加入上述各孔内，50微 升/孔。
[0067] 3.将96孔检测板(黑色)置于37°C，避光解育1-2小时，然后用酶标仪在激发波长/ 发射波长为365/450nm波长下读取各孔巧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测 样本的唾液酸酶活性。
[0068] 4.最后将得到的唾液酸酶活性/精子数目，计算得出单位酶活值（U AUS/104 sperm)。
[0069] 用于检测的孔内样本唾液酸酶活性应在0.3-5mU/ml范围内，如果超出则应将孔内 待测样本的唾液酸酶活性值调整在此线性范围之内。
【主权项】
1. 一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于:具体步骤如下： A、 精子的洗涤 收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液或者BWW培养液洗涤精子，充分除去残留的精浆 成分，再离心分离出精子； B、 精子的体外获能 向A步骤分离出的精子中加入B醫培养液，采用上游法，在5%的C02细胞培养箱中培养，收 获上游精子，计数精子数量，用体外获能液在5%的C02细胞培养箱中孵育精子3~4 h;离心分 离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本； C、 精子获能液中唾液酸酶活性的测定 (1) 用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯 度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本； (2) 用检测缓冲液稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔 内，再将检测板置于37°C，避光孵育1-2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶 活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/精子数目的值即 可。2. 根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于:所述的检 测板为96孔黑板。3. 根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于：用检测缓 冲液稀释至荧光试剂的浓度为〇. 〇5mM。4. 根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于:酶标仪在 激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。5. 根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于:所述的 检测缓冲液为含0.05 mmol/1乙酸钠和0.25yg/yl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。6. 根据权利要求5所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于:所述乙酸 钠的pH值为5-6。7. 根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于:所述的 体外获能液为含HSA 5mg/ml的HTF。8. 根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于:所述的唾 液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。9. 根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于:所述的荧 光试剂是2'-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠。
【专利摘要】本发明提供了一种体外获能后精子质量评估的方法。具体步骤如下：A、收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液或者BWW培养液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；B、向A步骤分离出的精子中加入BWW培养液，采用上游法，收获上游精子，计数精子数量，用体外获能液在5%的CO2细胞培养箱中孵育精子3~4 h；离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本；C、测定精子获能液中唾液酸酶的活性，最后得出唾液酸酶活性/精子数目的值即可。通过精子体外获能后获能液中唾液酸酶活性的检测，为临床原因不明的男性不育患者提供诊断依据及临床咨询。
【IPC分类】C12Q1/34
【公开号】CN105695557
【申请号】CN201610147269
【发明人】马芳, 马黔红, 潘倩
【申请人】四川大学华西第二医院
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年3月16日