发酵工艺的制作方法
【专利说明】
[0001] 与相关申请的交叉参考
[0002] 本专利申请要求来自于2013年9月22日提交的临时申请号61/880,970的优先权， 所述临时申请的内容W引用的方式在此并入。
技术领域
[0003] 本发明设及使用化合物用于改变发酵系统的代谢产物谱的方法。特别地，本发明 设及用于增加来源于乙酷乳酸的产物生产的方法。
【背景技术】
[0004] 用于运输的生物燃料是吸引人的汽油替代物，并且作为低浓度渗和物快速渗透燃 料市场。来源于天然植物来源的生物燃料比来源于化石资源的燃料(例如汽油)更具环境可 持续性，其使用允许减少所谓的化石二氧化碳(0)2)气体水平，所述二氧化碳气体由于燃料 燃烧而被释放到大气内。此外，生物燃料可在许多地区中局部产生，并且可作用于减少对输 入的化石能源的依赖。适合于用作生物燃料的醇包括乙醇、下醇和2,3-下二醇。
[0005] 乙醇正迅速地变成全世界主要的富氨液体运输燃料。2002年全世界的乙醇消耗估 计为108亿加仑。由于欧洲、日本、美国和几个发展中国家对乙醇的兴趣增加，燃料乙醇工业 的全球市场也预测在未来急剧增长。
[0006] 下二醇包括1，2-下二醇、1，3-下二醇、1，4-下二醇和2，3-下二醇，可视为具有超过 乙醇的各种优点。如同乙醇，下二醇可直接用作汽车燃料添加剂。它们还可相对容易地转化 成许多其他潜在更高价值和/或更高能量的产物。例如，2,3-下二醇可在两步工艺中容易地 转化成可用作航空燃料的八碳二聚体。
[0007] 2，3-下二醇由其双功能主链获得其多用性，即2个径基位于邻位C原子处，从而允 许该分子相当容易地转化成诸如下二締、下二酬、乙偶姻、甲基乙基酬等的物质。运些化学 化合物用作制造广泛范围的工业生产的化学品的基础分子。
[000引此外，2,3-下二醇可用作内燃机中的燃料。它在几个方面更类似于汽油而不是乙 醇。随着环境可持续性燃料生产和应用中的兴趣加强，对产生2,3-下二醇(通常被称为生物 下醇）的生物过程中的关注已增加。
[0009] 一氧化碳(CO)是有机材料例如煤炭或油和油衍生的产物不完全燃烧的主要副产 物。尽管含碳前体的完全燃烧获得C02和水作为唯一终产物，但一些工业工艺需要高溫，从 而有利于一氧化碳超过C02的积累。一个例子是钢铁工业，其中需要高溫来生成所需钢铁品 质。例如，据报道澳大利亚的钢铁工业每年产生超过500,000吨CO且将其释放到大气内。
[0010] 此外，CO也是合成气的主要组分，其中不同量的CO和H2通过含碳燃料的气化而生 成。例如，合成气可通过分解废木料和木材的有机生物质来产生，W生成燃料和更复杂化学 品的生产的前体。
[0011] CO释放到大气内可具有显著的环境影响。另外，可能需要缴纳排放税，从而增加工 业工厂的成本。因为CO是反应能量富含分子，所W它可用作各种化学品生产的前体化合物。 然而，运种有价值的原料未用于产生2，3-下二醇。
[0012] 已证实2,3-下二醇可通过含碳水化合物原料的微生物发酵而产生（Syu MJ，Appl Microbiol Biotechnol 55:10-18(2001)，Qin等人，Chinese J Qiem EngH(I) :132-136 (2006) )。2,3-下二醇还可通过来自作物例如甜菜、玉米、小麦和甘薦的生物质的微生物发 酵来产生。然而，运些碳水化合物原料的成本受其作为人类食物或动物饲料的价值影响，并 且用于2，3-下二醇生产的产淀粉或薦糖作物的栽培在所有地区中并非经济可持续性的。因 此，有利的是开发将成本更低和/或更丰富的碳资源转化成2,3-下二醇的技术。
[0013] 通过包含CO的气态底物的微生物发酵的2,3-下二醇产生已得到证实。然而，2,3-下二醇通过运些工艺的产生一直是次级产物。其他产物包括乙醇的产生在发酵中有利。下 二醇具有比此类发酵中产生的其他产物更大的价值。期望能够W运样的方式影响发酵，使 得2,3-下二醇的产生得到增加。先前已显示增加的2,3-下二醇生产率受微生物培养物的氨 消耗速率影响(W02012131627)。
[0014] 本领域存在W经济有益方式增加由工业气态底物产生有价值产物的能力的需要。 存在相对于其他产物生产增强2,3-下二醇生产的需要，所述其他产物在通过一氧化碳营养 菌的气态底物发酵中常规产生。
【发明内容】
[0015] 本发明提供了对本领域的需要的应答。本发明提供了用于改变发酵的代谢产物谱 的方法。特别地，本发明提供了用于增加通过乙酷乳酸的通量的方法。在某些实施例中，本 发明提供了用于增加来源于乙酷乳酸的一种或多种产物生产的方法。在特定实施例中，本 发明提供了用于增加通过气态底物的微生物发酵的2,3-下二醇生产的方法。本发明还提供 了用于增加相对于其他发酵产物例如乙醇和乙酸的2,3-下二醇生产的方法。
[0016] 在第一个方面，本发明提供了增加来源于乙酷乳酸的至少一种产物的生产的方 法。该方法包括给生物反应器提供气态底物，W产生至少一种发酵产物，所述生物反应器含 有在液体营养培养基中的一种或多种一氧化碳营养产乙酸微生物的培养物。
[0017] 在一个实施例中，该方法包括将至少一种化合物加入液体营养培养基。在一个实 施例中，至少一种化合物影响发酵的代谢产物谱。在一个实施例中，至少一种化合物对液体 营养培养基的添加抑制碳至支链氨基酸的通量。
[0018] 在一个实施例中，化合物是抑制将乙酷乳酸转化成支链氨基酸的一种或多种酶的 化合物。在一个实施例中，该化合物包含簇酸部分。
[0019] 在一个实施例中，该化合物选自在结构上与2-径基异下酸(2-HIBA)、乙酷乳酸、2-氧代-3-径基异戊酸和2，3-径基-3-甲基下酸(me thy化Utanoate)相关的化合物。在一个实 施例中，至少一种化合物选自2-径基异下酸(2-HIBA)、2-径基-2-甲基下酸、2-径基下酸、2-径基-3-甲基下酸、2-酬-3-径基异戊酸和2-酬异戊酸。
[0020] 在一个实施例中，至少一种发酵产物选自乙酸、乙醇、2,3-下二醇、2-下酬、2-下 醇、乙偶姻、异丙醇、乳酸醋、班巧酸醋、甲基乙基酬(MEK)、丙二醇、2-丙醇、乙偶姻、异下醇、 巧苹酸醋、下二締、聚乳酸、异下締、3-径基丙酸醋(3HP)、丙酬和脂肪酸。
[0021] 在一个实施例中，来源于乙酷乳酸的至少一种产物选自2,3-下二醇、2-下酬、2-下 醇和乙偶姻。
[0022] 在一个实施例中，来源于乙酷乳酸的至少一种产物的生产速率增加至少10%、或 至少20%、或至少30 %、或至少40 %、或至少50%、或至少60%、或至少70 %、或至少80 %、或 至少90%、或至少100 %、或至少110 %、或至少120%、或至少130 %、或至少140 %、或至少 150%。
[0023] 在第二个方面，本发明提供了增加2,3-下二醇生产的方法。在一个实施例中，该方 法包括给生物反应器提供气态底物，W产生2，3-下二醇，所述生物反应器含有在液体营养 培养基中的一种或多种一氧化碳营养产乙酸微生物的培养物。在一个实施例中，发酵产生 至少一种其他发酵产物。
[0024] 在一个实施例中，该方法还包括给液体营养培养基提供至少一种化合物。在一个 实施例中，至少一种化合物抑制碳至支链氨基酸的通量。
[0025] 在一个实施例中，化合物是抑制将乙酷乳酸转化成支链氨基酸的一种或多种酶的 化合物。在一个实施例中，该化合物包含簇酸部分。
[00%]在一个实施例中，该化合物选自在结构上与2-径基异下酸(2-HIBA)、乙酷乳酸、2-氧代-3-径基异戊酸和2,3-径基-3-甲基下酸相关的化合物。在一个实施例中，至少一种化 合物选自2-径基异下酸（2-HIBA)、2-径基-2-甲基下酸、2-径基下酸、2-径基-3-甲基下酸、 2-酬-3-?基异戊酸和2-酬异戊酸。
[0027] 在一个实施例中，至少一种其他发酵产物选自乙酸、乙醇、2-下酬、2-下醇、乙偶 姻、异丙醇、乳酸醋、班巧酸醋、甲基乙基酬(MEK)、丙二醇、2-丙醇、乙偶姻、异下醇、巧苹酸 醋、下二締、聚乳酸、异下締、3-径基丙酸醋(3HP)、丙酬和脂肪酸。
[0028] 在一个实施例中，至少一种其他发酵产物是至少乙醇。在一个实施例中，化合物的 添加引起发酵的代谢产物谱中的转变。在一个实施例中，将化合物加入发酵增加2,3-下二 醇的产生。
[0029] 在一个实施例中，2，3-下二醇的生产速率增加至少10 %、或至少20 %、或至少 30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少 100%、或至少110%、或至少120%、或至少130%、或至少140%、或至少150%。
[0030] 在第一个和第二个方面的实施例中，气态底物选自C0、C02、H2、N2、CH4及其混合 物。在特定实施例中，气态底物包含至少CO。
[0031] 在第=个方面，本发明提供了增加2,3-下二醇生产的方法。在一个实施例中，该方 法包括给生物反应器提供气态底物，W产生至少2，3-下二醇和乙醇，所述生物反应器含有 在液体营养培养基中的一种或多种一氧化碳营养产乙酸微生物的培养物，并且使用一种或 多种手段处理培养物W增加2,3-下二醇的生产速率。
[0032] 在一个实施例中，处理培养物的步骤包括将一种或多种化合物加入发酵中。在一 个实施例中，化合物是抑制将乙酷乳酸转化成支链氨基酸的一种或多种酶的化合物。在一 个实施例中，该化合物包含簇酸部分。在一个实施例中，一种或多种化合物选自在结构上与 2- HIBA、乙酷乳酸、2-氧代-3-径基异戊酸和2,3-二径基-3-甲基下酸相关的化合物。在一个 实施例中，一种或多种化学化合物选自2-HIBA、2-^基-2-甲基下酸、2-径基下酸、2-径基- 3- 甲基下酸、2-酬-3-径基异戊酸和2-酬异戊酸。
[0033] 在一个实施例中，气态底物还包含选自0)2、肥、肥、邸4及其混合物的至少一种底 物。
[0034] 在一个实施例中，处理培养物的方法包括将2-HIBA加入培养物中。在一个实施例 中，一个或多个进一步的处理步骤与将2-HIBA加入微生物培养物中结合进行。在一个实施 例中，控制2-HIBA对发酵的添加，使得发酵液中的2-HIBA浓度维持在预定水平。在某些实施 例中，2-HIBA的浓度维持在0.0 l至2.0g/L(0.096mM至19.2mM)。在一个实施例中，2-HIBA的 浓度维持在0. 〇5mM至50mM。
[00巧]在一个实施例中，将2-HIBA加入发酵增加2，3-下二醇的产生。在一个实施例中，2-HIBA的添加 W有利于2,3-下二醇而改善乙醇与2,3-下二醇的比率。在特定实施例中，乙醇 与2,3-BD0的比率是4:1、或3:1、或2:1、或1:1、或1:2。
[0036] 在一个实施例中，2，3-下二醇的生产速率增加至少10 %、或至少20 %、或至少 30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少 100%、或至少110%、或至少120%、或至少130%、或至少140%、或至少150%。
[0037] 在特定实施例中，微生物能够利用COW产生浓度为lOg/L或更多的2,3-抓0。在特 定实施例中，微生物能够利用COW产生浓度大于12g/L、或大于16g/L、或大于20g/L的2,3-抓0。在一个实施例中，微生物能够W至少lOg/L/天、或至少15g/L/天、或至少20g/L/天、或 至少25g/L/天的速率产生2，3-下二醇。
[0038] 在特定实施例中，微生物能够利用COW产生浓度为lOg/L或更多的乙醇。在特定实 施例中，微生物能够利用COW产生浓度大于15g/L、或大于20g/L、或大于30g/L、或大于40g/ L的乙醇。
[0039] 在一个实施例中，发酵还产生乙酸。在特定实施例中，微生物能够利用COW产生浓 度在lOg/LW下或更少的乙酸。
[0040] 在第一个至第=个方面的实施例中，一种或多种一氧化碳营养产乙酸微生物选自 梭菌属（Clostridium)、穆尔氏菌属(MooreIla)、产醋杆菌属（Oxobacter)、消化链球菌属 。邱tostreptococ州S)、乙酸杆菌属（Acetobacterium)、真细菌属化ubacterium)或下酸杆 菌属（Butyribacterium)。在各个实施例中，微生物选自自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌（Clostridium Ijungd址Ii)、食幾基化物梭菌（Clostridium carboxidivorans)、Clostridium drakei、粪味梭菌（Clostridium scatologenes)、乙酉《梭 菌（Clostridium aceticum)、蚁酸乙酸梭菌（Clostridium formicoaceticum)、大梭菌 (Clostridium magnum)、甲基营养下酉《杆菌（Butyribacterium methylotrphoicum)、伍氏 乙酸杆菌（Acetobacterium woodii )、己氏嗜喊菌（Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、粘液真杆菌（Eubacterium limosum)、热乙酸穆尔氏菌（Moorella thermoacetica)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、球形鼠抱菌、 普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacter kiuvi)。
[0041] 在特定实施例中，微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个特定实施例中，微生 物是自产乙醇梭菌。在一个特定实施例中，微生物具有登录号DSMZ10061或DSMZ23693的鉴 定特征。
[0042] 在第四个方面，本发明提供了用于增加来源于乙酷乳酸的至少一种产物的生产的 方法，该方法包括给生物反应器提供气态底物，W产生至少一种发酵产物，所述生物反应器 包含在液体营养培养基中的至少一种重组产乙酸一氧化碳营养微生物的培养物;其中所述 至少一种重组微生物具有至少一种遗传修饰，W增加丙酬酸至乙酷乳酸的转化。
[0043] 在一个实施例中，至少一种遗传修饰选自酬醇酸还原异构酶基因中的失活突变， W及适合提供乙酷乳酸合酶基因的过表达的修饰。
[0044] 在一个实施例中，重组微生物具有提供与亲本微生物相比较的乙酷乳酸合酶的过 表达的修饰；W及酬醇酸还原异构酶基因中的失活突变两者，其中酬醇酸还原异构酶的活 性与亲本微生物相比较是减少的。
[0045] 在一个实施例中，至少一种遗传修饰导致乙酷乳酸的产生增加。在一个实施例中， 酬醇酸还原异构酶的活性减少抑制支链氨基酸的产生。在一个实施例中，乙酷乳酸合酶基 因的增加活性增加了丙酬酸至乙酷乳酸的转化率。
[0046] 在第五个方面，本发明提供了一氧化碳营养产乙酸微生物，其包含在酬醇酸还原 异构酶基因中的失活突变。
[0047] 在一个实施例中，在气态底物的生长和/或发酵后，与亲本微生物相比较，一氧化 碳营养产乙酸微生物具有减少的将乙酷乳酸转化为支链氨基酸的能力。
[0048] 在一个实施例中，一氧化碳营养微生物还包含适合提供乙酷乳酸合酶基因的过表 达的一种或多种遗传修饰。
[0049] 在第六个方面，本发明提供了一氧化碳营养产乙酸微生物，其包含适合增加乙酷 乳酸合酶的活性水平的一种或多种遗传修饰。
[0050] 在一个实施例中，适合增加乙酷乳酸合酶的水平的一种或多种遗传修饰选自内源 性分解代谢乙酷乳酸合酶的过表达、内源性合成代谢乙酷乳酸合酶的过表达、内源性乙酷 乳酸合酶由外源性分解代谢乙酷乳酸合酶的取代、内源性乙酷乳酸合酶由外源性合成代谢 乙酷乳酸合酶的取代、W及内源性合成代谢合酶亚基的过表达，所述亚基对通过支链氨基 酸的反馈抑制不敏感。
[0051] 在一个实施例中，在气态底物的生长和/或发酵