一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法及其试剂盒的制作方法

一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法，其中包括如下特征：构建成干扰素γ信号肽和肿瘤细胞结合多肽并链接可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞，高表达新的多肽?可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性，同时细胞因子诱导杀伤细胞增殖倍数达到1000倍以上，表达CD3+/CD56+为40％以上，CD16+为30％以上，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体细胞因子诱导杀伤细胞增殖培养的试剂盒，具有高效的抗肿瘤功能。
【专利说明】
一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法及其试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法，其中包括如下特征:构建成干扰素γ信号肽(Interferon γ signal peptide，IFN γ-SP)和肿瘤细胞结合多肽(Tumor cells binding peptide，TCBP)并链接可结晶片段域(Fragment crystal I izable domain，Fe)重链的第2和3恒定区(second and thirdconstant domain，Ch2and Ch3)基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞(Cytokine-1nduced killer cells，CIK)，高表达新的多肽-可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性;本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体细胞因子诱导杀伤细胞增殖培养的试剂盒，具有高效的抗肿瘤功能。
【背景技术】
[0002]细胞因子诱导杀伤细胞(Cytokines-1nduced Killer cells，CIK)是目前在国内进行临床治疗常见的免疫细胞技术。目前CIK细胞主要通过干扰素γ、抗CD3单抗和白介素2等共同诱导作用获得的，表达CD3+/CD56+双阳性细胞。其抗肿瘤主要机制为释放颗粒酶和穿孔素直接杀死肿瘤细胞，以及通过凋亡配体作用引起肿瘤细胞的凋亡作用。
[0003]然而，CIK细胞在临床上治疗恶性肿瘤方面疗效还非常有限，根据临床治疗数据统计包括肿瘤完全消失的完全缓解、肿瘤部分缩减的部分缓解和肿瘤未增大的疾病稳定在内的有效率在10-20%之间，还远远不能满足临床治疗恶性肿瘤的需要。影响CIK细胞治疗癌症的效果的关键问题是CIK细胞数量、表型高低和杀伤功能。提高CIK细胞数量和CD3+/CD56+表型，均能有效提高其治疗癌症的有效率，已有一些临床单位通过提高CIK细胞数量和CD3+/⑶56+表型来增强癌症治疗效果。
[0004]本发明提供了以干扰素γ信号肽和肿瘤细胞结合多肽并链接可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞，高表达新的多肽-可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，其CD3+/CD56+表型显著提高并表达CD 16分子，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性，增殖倍数达1000倍以上，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性，将显著提高临床疗效和延长患者生存期。

【发明内容】

[0005]本发明针对现有增殖培养CIK细胞技术的不足，特别是因CIK细胞培养获得临床治疗需要的细胞表型较低，以及单纯依赖释放颗粒酶和穿孔素杀伤肿瘤的作用特异性低与杀伤效果力度有限，因而造成杀瘤活性低和大多数恶性肿瘤治疗不佳。本发明通过前期研究实验发现通过干扰素γ信号肽引导，将含肿瘤细胞结合多肽和可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段融合蛋白导入肿瘤细胞，有助于肿瘤细胞结合多肽结合肿瘤细胞，并锚定可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段在肿瘤细胞胞膜外，与细胞因子诱导杀伤细胞表达CD16分子结合激活抗体依赖性的细胞毒性活性，增强了对肿瘤细胞杀伤活性与临床治疗疗效。
[0006]抗体依赖性的细胞毒性活性(Antibody-dependentcellular cytotoxicity,ADCC)是单克隆抗体临床疗效中关键的效应子功能，通过固有免疫细胞表达的Fcy受体与抗体Fe域结合而引发的抗肿瘤作用，例如自然杀伤细胞和巨噬细胞。CIK是一种自然杀伤细胞样的免疫细胞，在临床上大量应用于治疗恶性肿瘤，通过其表达肿瘤细胞多肽和人免疫球蛋白Gl的Fe域，利用发现的肿瘤细胞结合多肽可以锚定在肿瘤细胞膜上，其链接的Fe域Ch2和Ch3暴露在细胞膜外，可以与CIK表达的⑶16分子结合，从而产生特异性的ADCC作用，可产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。
[0007]本发明涉及一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法，其特征在于，构建成干扰素γ信号肽和肿瘤细胞结合多肽并链接可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞，高表达新的多肽-可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性;激活细胞因子诱导杀伤细胞增殖倍数达到1000倍以上，其表达⑶3+/CD56+为40%以上，以及CD16+为30%以上，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性;培养到第21天的CIK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了SP-(TCBP)n-L-Fc病毒载体的CIKs其表达SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未转染的CIKs为100倍以上;蛋白印迹技术检测其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表达水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒转染的CIKs培养上清中其灰度高于2000以上。
[0008]本发明所述新的多肽-可结晶片段域重组基因由干扰素γ信号肽、肿瘤细胞结合多肽和可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段构成，干扰素γ信号肽引导融合蛋白导入肿瘤细胞，有助于肿瘤细胞结合多肽结合肿瘤细胞，并锚定可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段在肿瘤细胞胞膜外，与细胞因子诱导杀伤细胞表达CD16分子结合激活抗体依赖性的细胞毒性活性。
[0009]为了提高肿瘤细胞结合多肽对肿瘤细胞受体的识别和结合，本发明所述肿瘤细胞结合多肽，优选地，链接两个或两个以上肿瘤细胞结合多肽，可以是同样的或者不同的肿瘤细胞结合多肽。针对不同的肿瘤，肿瘤细胞结合多肽也不同，例如前列腺癌为与前列腺特异抗原特异结合的多肽，乳腺癌的为与乳腺癌人表皮生长因子受体-2特异结合的多肽，肝癌的为与甲胎蛋白特异结合的多肽、肺癌和肠癌等为与癌胚抗原特异结合的多肽等。
[0010]本发明所述可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段，优选地，该片段中第24个丝氨酸突变为天冬氨酸和第117个异亮氨酸突变为谷氨酸，突变的可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段与CD16分子具有更强亲和性。
[0011]本发明所述方法中细胞因子诱导杀伤细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的单个核细胞。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
[0012]本发明所述将人IFNy-SP、多个TCBP和Fc-D/E基因序列通过化学合成获得，在两个TCBP之间以及TCBP和Fc-D/E之间均引入连接多肽，其基因序列为GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFN γ -SP、(TCBP)2和Fc-D/E的cDNA，SPSP-(TCBP)n-L-Fc。
[0013]培养到第21天的CIK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了SP-(TCBP)n-L-Fc病毒载体的CIKs其表达SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未转染的CIKs为100倍以上。蛋白印迹技术检测其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表达水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒转染的CIKs培养上清中其灰度高于2000以上。
[0014]本发明所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得细胞因子诱导杀伤细胞，增殖倍数达1000倍以上，培养到21天细胞因子诱导杀伤细胞数达3 X 19以上。
[0015]本发明所述方法中培养获得细胞因子诱导杀伤细胞，高表达其特异标志物⑶3+/⑶56+，阳性率高于40%以上，CD16+阳性率超过30%以上，所述的细胞因子诱导杀伤细胞引发抗体依赖性的细胞毒性活性，体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。
[0016]本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI1640培养基加入5-500ng/ml IL-15、5_500ng/ml IL-18，l_500ng/ml鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和 10_2000IU/mlIL-2和10 % (体积比)自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，如CellGro SCGM、AIM_V、X_VIVO和GT-T551 等，含有5_500ng/ml IL-15、5_500ng/ml IL-18,
l-500ng/ml鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和 10-2000IU/ml IL-2。
[0017]本发明还提供了一种制备介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:
[0018](I)获得上述的稳定表达SP-(TCBP)n-L-Fc的病毒载体；
[0019](2)CIK细胞因子，包括IFN-γ、IL-15、IL-18、鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和IL-2;
[0020](3)淋巴细胞培养基，包括RPMI 1640和无血清培养基；
[0021](4)淋巴细胞分离液；
[0022](5)生理盐水；
[0023](6)使用说明书；
[0024]其中，所述使用说明书包括上述的方法。
[0025]本发明还提供了上述方法及其试剂盒制备CIK细胞，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。
【附图说明】
[0026]图1表示为构建的多肽-可结晶片段域融合蛋白示意图；
[0027]图2表示为实施例二制备的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞后培养到21天后的表达水平；
[0028]图3表示为蛋白印迹技术检测实施例二制备的SP-(TCBP)2-L-Fc融合蛋白在SP-(TCBP) 2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞中培养上清表达水平；
[0029]图4表示为实施例二制备的前列腺癌患者SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞流式细胞检测；
[0030]图5表示为实施例二制备的晚期前列腺癌和乳腺癌患者来源SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞对PC-3的杀伤活性；
[0031]图6表示为实施例二制备的晚期前列腺癌和乳腺癌患者来源SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞对MCF-7的杀伤活性；
[0032]图7表示为荷人前列腺癌PC-3SCID鼠模型CIK细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线。
【具体实施方式】
[0033]本发明发现干扰素γ信号肽和肿瘤细胞结合多肽并链接可结晶片段域重链的第2和3恒定区的基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞，高表达新的多肽-可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性;激活细胞因子诱导杀伤细胞增殖倍数达到1000倍以上，其表达⑶3+/CD56+为40%以上，以及CDl6+为30 %以上，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性。
[0034]对本发明涉及的一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法进行具体说明。
[0035]本发明涉及一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法，其特征在于，构建成干扰素γ信号肽和肿瘤细胞结合多肽并链接可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞，高表达新的多肽-可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性;激活细胞因子诱导杀伤细胞增殖倍数达到1000倍以上，其表达⑶3+/CD56+为40%以上，以及CDl6+为30 %以上，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性。
[0036]本发明所述新的多肽-可结晶片段域重组基因由干扰素γ信号肽、肿瘤细胞结合多肽和可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段构成，干扰素γ信号肽引导融合蛋白导入肿瘤细胞，有助于肿瘤细胞结合多肽结合肿瘤细胞，并锚定可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段在肿瘤细胞胞膜外，与细胞因子诱导杀伤细胞表达CD16分子结合激活抗体依赖性的细胞毒性活性。
[0037]本发明所述肿瘤细胞结合多肽，优选地，链接两个或两个以上肿瘤细胞结合多肽，可以是同样的或者不同的肿瘤细胞结合多肽。针对不同的肿瘤，肿瘤细胞结合多肽也不同，例如前列腺癌为与前列腺特异抗原特异结合的多肽，乳腺癌为与乳腺癌人表皮生长因子受体-2的多肽，肝癌的为与甲胎蛋白特异结合的多肽、肺癌和肠癌等为与癌胚抗原特异结合的多肽。
[0038]本发明所述可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段，优选地，该片段中第24个丝氨酸突变为天冬氨酸和第117个异亮氨酸突变为谷氨酸，突变的可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段与CD16分子具有更强亲和性。
[0039]将人IFNy-SP、多个TCBP和Fc-D/E基因序列通过化学合成获得，在两个TCBP之间以及TCBP和Fc-D/E之间均引入连接多肽，其基因序列为GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFN γ -SP、(TCBP) 2和Fc-D/E的cDNA，即 SP-(TCBP)n-L-Fc ；
[0040]将SP-(TCBP)n-L-Fc的目的DNA片段和pUC229载体HindIII/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于4°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定;PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合SP-(TCBP)n-L-Fc大小和序列后，将测序正确的菌液转接于1ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37°C培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80°C超低温冰箱中长期保存；
[0041]将SP-(TCBP)n-L-Fc的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体HindIII/BamH I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；
[0042]取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个1cm的培养皿6 X 16个细胞数接种于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜;第二天转染前移去培养液，换5ml Opt1-ΜΕΜ培养液；取9yg包装混合液和3yg慢病毒表达质粒加入1.5mlOpt1-ΜΕΜ中，轻轻混匀，取36μ1 lipofectamine200(^pAl.5ml Opt1-ΜΕΜ中，轻轻混匀，室温放置5min ；混合质粒溶液和I ipofectamine 2000稀释液，置室温20min ；混合液缓慢滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37°C、5 %CO2细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入1ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10%血清的细胞培养基20ml，于37°C、含5%⑶2培养箱内继续培养48-72h；
[0043]根据细胞状态，收集转染后48h的293FT细胞上清液;于4°C，4000g离心lOmin，除去细胞碎片；以0.45μπι滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4°C;离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬;经充分溶解后，高速离心lOOOOrpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分装，保存于-80°C超低温冰箱。
[0044]本发明所述方法中细胞因子诱导杀伤细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的单个核细胞。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
[0045]采集来源于患者自体外周血，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞后，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到2-5 X 16细胞/ml，并补充1000活性单位(IU)/ml IFN-γ和10 %自体血清，每20ml加入到75cm2培养瓶中，于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养24h ； 24小时后加入5-500ng/ml IL-15、5_500ng/ml IL-18，l_500ng/ml鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和 10-2000IU/ml IL-2，于37°C、含5%⑶2培养箱内培养2天。第3天补充含5-500ng/ml IL_15、5_500ng/ml IL-18，l_500ng/ml鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和 10_2000IU/ml IL-2和 10% 自体血清的RPMI 1640培养基，继续培养到第5天。第5天离心收获CIK细胞，并通过苔盼兰计数。
[0046]第5天以3 X 16细胞/ml CIK细胞加入到六孔培养板，每孔为2ml，于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养过夜。第6天将20μ1 lE+7TU/ml重组bng慢病毒加入到人CIK的六孔培养板中，体系为2 m I，混匀，3 7 °C、5 %⑶2的培养箱中孵育8 -12个小时后，更换完全培养液R P MI16404ml，所述完全培养液含10-2000IU/ml IL-2和10%自体血清；当CIK细胞生长密度达到6 X 16细胞/ml时，转入75cm2培养瓶中生长，6孔对应I个培养瓶，补充完全培养液RPMI 1640到50ml培养体系;于37°C、含5%C02培养箱内培养到第15-21天，期间根据CIK细胞密度和培养基颜色变化补充含10-2000IU/ml IL-2和10%自体血清新鲜完全培养液RPMI 1640，并扩瓶到175cm2培养瓶中或转移到1.5L培养袋中生长。
[0047]培养到第21天的CIK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了SP-(TCBP)n-L-Fc病毒载体的CIKs其表达SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未转染的CIKs为100倍以上。蛋白印迹技术检测其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表达水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒转染的CIKs培养上清中其灰度高于2000以上。
[0048]本发明所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得细胞因子诱导杀伤细胞，增殖倍数达1000倍以上，培养到21天细胞因子诱导杀伤细胞数达3 X 19以上。
[0049]本发明所述方法中培养获得细胞因子诱导杀伤细胞，高表达其特异标志物CD3+/⑶56+，阳性率高于40%以上，CD16+阳性率超过30%以上，所述的细胞因子诱导杀伤细胞引发抗体依赖性的细胞毒性活性，体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。
[0050]本发明还提供了一种制备介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括；
[0051](I)获得上述的稳定表达SP-(TCBP)n-L-Fc的病毒载体；
[0052](2)CIK细胞因子，包括IFN-γ、IL-15、IL-18、鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和IL-2;
[0053](3)淋巴细胞培养基，包括RPMI 1640和无血清培养基；
[0054](4)淋巴细胞分离液；
[0055](5)生理盐水；
[0056](6)使用说明书；
[0057]其中，所述使用说明书包括上述的方法。
[0058]作为本发明CIK细胞扩增培养中使用的细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶、细胞培养袋，可例举，为75cm2细胞培养瓶、175cm2细胞培养瓶、250mL细胞培养袋等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选细胞培养袋。
[0059]本发明的制造方法中对CIK细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50 %小牛血清、40 %细胞培养液和10 % 二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为CIK细胞培养液。
[0060]在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优选为5% (体积比)。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。
[0061]本发明的自体CIK细胞增殖的制备使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37°C、5%C02等条件下培养。还可以实施如下等操作:间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。
[0062]本发明还提供CIK细胞在临床应用中多次的抗肿瘤治疗，更好地在生物体内发挥抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述CIK细胞还具有如下优点，多次CIK细胞治疗将更好地引发CIK细胞杀瘤活性，抑制调节性T淋巴细胞免疫抑制活性，产生高效、长效地抗肿瘤免疫效应，因此非常利于患者疗效的提高和生存期的延长。
[0063]以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
[0064]实施例一
[0065]重组SP-(TCBP)2-L-Fc基因构建及其慢病毒的制备
[0066]该新的多肽-可结晶片段域重组基因由干扰素γ信号肽、两个肿瘤细胞结合多肽和可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段构成，可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段，第24个丝氨酸突变为天冬氨酸和第117个异亮氨酸突变为谷氨酸，S卩Fc-D/E，见图1，即多肽-可结晶片段域融合蛋白示意图。
[0067]将人IFNy -SP、2个TCBP和Fc-D/E基因序列通过化学合成获得，在两个TCBP之间以及TCBP和Fc-D/E之间均引入连接多肽，其基因序列为GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFN γ -SP、( TCBP) 2和Fc-D/E的 cDNA，即 SP- (TCBP) 2-L-Fc ；
[0068]将SP-(TCBP)2-L-Fc的目的DNA片段和pUC229载体HindIII/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于4°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定;PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合SP-(TCBP)2-L-Fc大小和序列后，将测序正确的菌液转接于1ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37°C培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80 0C超低温冰箱中长期保存;所述SP-( TCBP) 2-L-Fc大小为858bp;
[0069]将SP-(TCBP)2-L-Fc的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体HindIII/BamH I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；
[0070]取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个1cm的培养皿6 X 16个细胞数接种于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜;第二天转染前移去培养液，换5ml Opt1-ΜΕΜ培养液；取9yg包装混合液和3yg慢病毒表达质粒加入1.5mlOpt1-ΜΕΜ中，轻轻混匀，取36μ1 lipofectamine200(^pAl.5ml Opt1-ΜΕΜ中，轻轻混匀，室温放置5min ；混合质粒溶液和I ipofectamine 2000稀释液，置室温20min ；混合液缓慢滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37°C、5 %CO2细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入1ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃;缓慢加入含10 %血清的细胞培养基20ml，于37°C、含5 % CO2培养箱内继续培养72h。
[0071]根据细胞状态，收集转染后48h的293FT细胞上清液;于4°C，4000g离心lOmin，除去细胞碎片；以0.45μπι滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4°C;离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬;经充分溶解后，高速离心lOOOOrpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分装，保存于-80°C超低温冰箱，即制备成了 SP-(TCBP) 2-L-Fc 慢病毒。
[0072]实施例二
[0073]介导抗体依赖性细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备
[0074]采集晚期前列腺癌和乳腺癌患者30ml自体外周血(与其签署知情同意书)，加入等量I X PBS稀释，沿离心管管壁轻轻叠加于淋巴细胞分离液上，形成明显界面，室温下2000rpm离心20min，吸取界面层的PBMC，用I X PBS(pH值为7.4)洗涤两次。苔盘兰计数后，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到3 X 16细胞/ml，并补充1000活性单位(IU)/ml IFN-γ和10 %自体血清，每20ml加入到75cm2培养瓶中，于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养24h ； 24小时后加入50ng/ml IL_15、50ng/ml IL_18，20ng/ml鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和500IU/ml IL-2,于37°C、含5%⑶2培养箱内培养2天。第3天补充含50ng/ml IL-15、50ng/ml IL-18,20ng/ml0KT3和500IU/ml IL_2和10%自体血清的RPMI1640培养基，继续培养到第5天。第5天离心收获CIK细胞，并通过苔盼兰计数。
[0075]第5天以3 X 16细胞/ml CIK细胞加入到六孔培养板，每孔为2ml，于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养过夜。第6天将20μ1 lE+7TU/ml重组SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒加入到人CIK的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37°C、5 %⑶2的培养箱中孵育8-12个小时后，更换完全培养液RPMI 1640 4ml，所述完全培养液含500IU/ml IL-2和10%自体血清；当CIK细胞生长密度达到6 X 16细胞/ml时，转入75cm2培养瓶中生长，6孔对应I个培养瓶，补充完全培养液RPMI 1640到50ml培养体系;于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养到第21天，期间根据CIK细胞密度和培养基颜色变化补充含500IU/ml IL-2和10%自体血清新鲜完全培养液RPMI 1640，并扩瓶到175cm2培养瓶中或转移到1.5L培养袋中生长。转染晚期前列腺癌患者CIK的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒中TCBP为与前列腺特异抗原特异结合的多肽基因序列，转染晚期乳腺癌患者CIK的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒中的为与乳腺癌人表皮生长因子受体-2特异结合的多妝基因序列。
[0076]图2为SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞后培养到21天后其的表达水平。在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书(美国Invitrogen公司)检测，培养到第21天的CIK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了SP-(TCBP)2-L-Fc病毒转染晚期前列腺癌和乳腺癌患者的CIKs其表达SP-(TCBP)2-L-Fc基因分别高于未转染的CIKs为125.1和112.34倍。ADPC-CIK为SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染的前列腺癌患者来源CIK细胞，ADBC-CIK为SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染的乳腺癌患者来源CIK细胞，BPC-CIK为空白慢病毒转染的前列腺癌患者来源CIK细胞，BBC-CIK为空白慢病毒转染的乳腺癌患者来源CIK细胞，PC-CIK为前列腺癌患者来源CIK细胞，BC-CIK为乳腺癌患者来源CIK细胞。
[0077]实施例三
[0078]介导抗体依赖性细胞毒性的CIK细胞蛋白印迹和流式细胞检测
[0079]取实施例二制备的晚期前列腺癌、乳腺癌患者和正常健康人来源第15天培养获得的CIK细胞上清各20yL，进行蛋白凝胶电泳。根据目的蛋白的分子量，配制10%分离胶，浓缩胶浓度为5%。待检测蛋白样品上样量:20yg/孔。电泳条件:浓缩胶恒压90V，约20分钟;分离胶恒压120V，通过标准分子量预染蛋白来确定电泳停止时间。湿转法，转膜条件:300mA恒流;0.45μπι孔径PVDF膜，转膜时间80分钟。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。封闭:将膜完全浸没于5% (mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)的转膜缓冲液(含体积比3 %吐温-20，TBST)中，室温下水平摇床孵育I小时。一抗孵育:5 % (mg/mL)BSA-TBST稀释生物素标记的兔抗人Fe多抗1:20000，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；4°C水平摇床孵育过夜。次日，洗膜:TBST洗3次，每次1分钟。二抗孵育:5 % (mg/mL) BSA-TBST稀释链霉亲和素标记的辣根过氧化酶(HRP) 1:1000，室温孵育40分钟。洗膜:TBST洗膜3次，每次1分钟。化学发光底物ECL滴加到膜的蛋白面，反应3-5分钟;胶片曝光:10秒-5分钟(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2分钟，定影。
[0080]胶片用扫描仪扫描为大于300DPI的TIF格式图片，使用QuantityOne分析软件(B1-Rad公司)进行灰度分析，图3为蛋白印迹技术检测SP-(TCBP)2-L-Fc融合蛋白在SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染晚期前列腺癌和乳腺癌患者来源CIK细胞中培养上清，以及SP-(1'0^)2-1^^融合蛋白大肠杆菌中表达水平(阳性对照)，即western blotting结果图，灰度分析结果显示SP-(TCBP)2-L-Fc灰度值的分别为2226、2036、2731、0和282。第I条带为SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染晚期前列腺癌CIK培养上清，第2条带为SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染晚期乳腺癌CIK培养上清，第3条带为SP-(TCBP)2-L-Fc融合蛋白大肠杆菌中表达，第4条带为晚期前列腺癌CIK培养上清，第5条带为晚期乳腺癌CIK培养上清。
[0081]取实施例二制备的晚期前列腺癌、乳腺癌患者和正常健康人来源第15天培养获得的I X 16CIK细胞，进行流式抗体染色检测分析。CIK细胞一组分别为20yL鼠抗人CD16-FITC、20yL鼠抗人CD56-PE和20yL鼠抗人CD3-PerCP;另一组分别为20yL鼠抗人CD3-FITC、20yL鼠抗人CD8-PE和20yL鼠抗人CD4-PerCP;同型对照组为20yL mIgGl_FITC、20yL mlgGl-PE和20yL mlgGl-PerCP;放置4°C冰箱染色30分钟后用PBS洗涤3次，然后在FACS Calibur仪器(美国BD公司)上机检测和分析。
[0082]图4为实施例二制备的前列腺癌患者SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞流式细胞检测，该CIK细胞⑶3和⑶56双阳性率为43.79 %，CD16阳性率为37.39 % ;其中⑶3阳性率为95.98%;实施例二制备的乳腺癌患者和正常人SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞⑶3和⑶56双阳性率均超过40%以上，CD16阳性率超过30%以上。而未转染的CIK细胞⑶3和⑶56双阳性率均在20 %左右，⑶16阳性率低于1 %以下。
[0083]实施例四
[0084]介导抗体依赖性细胞毒性的CIK细胞体外杀瘤试验
[0085]分别以前列腺癌细胞系PC-3和乳腺癌细胞系MCF-7为靶细胞，以实施例二中制备的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞作为效应细胞，按效靶比40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1分别加入96孔培养板中，然后置于37 °C、5 %C02条件下培养4h，均设3个复孔。采用LDH细胞毒实验法测定CIK活性:吸取上清液50yL，置于96孔板中，加入LDH基液50yL，室温避光30min，加入50yL终止液终止反应，490nm波长处测吸光度(OD)值。按下列公式分别计算PC-3和MCF-7细胞的杀伤率:杀伤率=(实验组OD值-效应细胞自然释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)X 100%。
[0086]图5为晚期前列腺癌和乳腺癌患者来源SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞对PC-3的杀伤活性，随着效靶比提高，细胞毒性活性也不断提高，SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染前列癌患者CIK细胞杀伤PC-3杀伤毒性显著高于SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染乳腺癌患者CIK细胞和未转染的CIK细胞，P值分别为0.03和0.004。图6为晚期前列腺癌和乳腺癌患者来源SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞对MCF-7的杀伤活性，随着效靶比提高，细胞毒性活性也不断提高，SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染乳腺癌患者CIK细胞杀伤MCF-7杀伤毒性显著高于SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染前列癌患者CIK细胞和未转染的CIK细胞，P值分别为
0.035 和0.002。
[0087]实施例五
[0088]介导抗体依赖性细胞毒性的CIK细胞体内杀瘤实验中的作用
[0089]24只8周SCID裸鼠腹部侧翼皮下注射5 X 16前列腺癌细胞系PC-3，饲养7天后，随机分为A、B、C和D 4组，每组6只:A组为实施例二制备的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染前列癌患者CIK细胞治疗组;B组为实施例二制备的空白慢病毒转染前列癌患者CIK细胞治疗组;C组为实施例二制备的未转染的前列癌患者CIK细胞治疗组;D组为生理盐水安慰剂组。A组在SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染前列癌患者CIK细胞培养到第14天和第16天尾静脉注射2 X 14细胞/克，B组在空白慢病毒转染前列癌患者CIK细胞培养到第14天和第16天尾静脉注射2X14细胞/克，C组在未转染前列癌患者CIK细胞培养到第14天和第16天尾静脉注射2 X 14细胞/克，D组与A、B和C治疗组同时间，尾静脉注射同体积的生理盐水，各lmL。治疗后分别于7d、14d、21d、28d和35d拉颈处死，取荷前列腺癌PC-3SCID鼠模型肿瘤组织，计算鼠模型荷瘤大小。
[0090]图7荷前列腺癌PC-3SCID鼠模型CIK细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线，生理盐水组C和ADPC-CIK治疗组A、BPC-CIK治疗组B与PC-CIK治疗组C相比，治疗组A、治疗组B与治疗组C中前列癌肿瘤大小缩少，但治疗组A与治疗组B与治疗组C相比前列癌肿瘤大小缩少更为明显，P值分别为0.013和0.011，表明SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染前列癌患者CIK细胞引发了强大的体内杀瘤活性。
【主权项】
1.一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法，其特征在于，构建成干扰素γ信号肽(IFNy-SP)和肿瘤细胞结合多肽(TCBP)并链接可结晶片段域(Fe)重链的第2和3恒定区(Ch2 and Ch3)的基因片段，重组到病毒载体上并转染人细胞因子诱导杀伤细胞(CIK); 其高表达新的多肽-可结晶片段域重链的第2和3恒定区融合蛋白，可引发抗体依赖性的细胞毒性活性;激活细胞因子诱导杀伤细胞增殖倍数达到1000倍以上，其表达CD3+/CD56+为40 %以上，以及⑶16+为30 %以上，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性； 培养到第21天的CIK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了 SP-(TCBP)n-L-Fc病毒载体的CIKs其表达SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未转染的CIKs为100倍以上;蛋白印迹技术检测其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表达水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒转染的CIKs培养上清中其灰度高于2000以上。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新的多肽-可结晶片段域重组基因由干扰素γ信号肽、肿瘤细胞结合多肽和可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段构成，干扰素γ信号肽引导融合蛋白导入肿瘤细胞，有助于肿瘤细胞结合多肽结合肿瘤细胞，并锚定可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段在肿瘤细胞胞膜外，与细胞因子诱导杀伤细胞表达CD16分子结合激活抗体依赖性的细胞毒性活性;所述肿瘤细胞结合多肽，优选地，链接两个或两个以上肿瘤细胞结合多肽，可以是同样的或者不同的肿瘤细胞结合多肽； 优选，针对前列腺癌肿瘤细胞，所述多肽为与前列腺特异抗原特异结合的多肽； 优选，针对乳腺癌肿瘤细胞，所述多肽为与乳腺癌人表皮生长因子受体-2特异结合的多肽； 优选，针对肝癌肿瘤细胞，所述多肽为与甲胎蛋白特异结合的多肽； 优选，针对肺癌或肠癌肿瘤细胞，所述多肽为与癌胚抗原特异结合的多肽。3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段，优选地，该片段中第24个丝氨酸突变为天冬氨酸和第117个异亮氨酸突变为谷氨酸，即Fc-D/E，突变的可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段与CD16分子具有更强亲和性;所述细胞因子诱导杀伤细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血或胎盘血的单个核细胞。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于， 将人IFNy-SP、多个TCBP和Fc-D/E基因序列通过化学合成获得，在两个TCBP之间以及TCBP和Fc-D/E之间均引入连接多肽，其基因序列为GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFNγ -SP、(TCBP) 2和Fc-D/E的 cDNA，即 SP-(TCBP)n-L-Fc ； 将SP-(TCBP)n-L-Fc的目的DNA片段和pUC229载体Hind 111/^1111!11双酶切后，在了40嫩连接酶作用下，将两者于4°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆的PCR鉴定和测序鉴定；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合SP-(TCBP)n-L-Fc大小和序列后，将测序正确的菌液转接于1ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37 °C培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80 V超低温冰箱中长期保存； 将SP-(TCBP)n-L-Fc的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体Hind III/BamH I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定； 取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个1cm的培养皿6X 16个细胞数接种于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜;第二天转染前移去培养液，换5ml Opt1-MEM培养液;取9yg包装混合液和3yg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opt1-MEM中，混匀，取36μ1 Iipof ectamine2000加入1.5ml Opt1-ΜΕΜ中，混匀，室温放置5min ；混合质粒溶液和Iipofectamine 2000稀释液，置室温20min;混合液缓慢滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37 °C、5 % CO2细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入1ml的PBS液清洗一次，晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃;加入含10%血清的细胞培养基20ml，于37 °C、含5%?)2培养箱内继续培养48-7211; 根据细胞状态，收集转染后48h的293FT细胞上清液;于4°C，4000g离心1min，除去细胞碎片；以0.45μπι滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4°C;离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心lOOOOrpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分装，保存于-80 °C超低温冰箱，即制备成了SP-(TCBP)n-L-Fc慢病毒。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于， 采集来源于患者自体外周血，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞后，用RPMI1640培养基重悬并稀释到2-5 X 16细胞/ml，并补充1000活性单位(IU)/ml IFN-γ和10%自体血清，每20ml加入到75cm2培养瓶中，于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养24h; 24小时后加入5-500ng/ml IL-15、5_500ng/ml IL-18，l_500ng/ml鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和 10-2000IU/ml IL-2，于37°C、含5%C02培养箱内培养2天;第3天补充含5-500ng/ml IL-15、5_500ng/mlIL-18，l-500ng/ml鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和 10-2000IU/ml IL-2和 10% 自体血清的RPMI1640培养基，继续培养到第5天;第5天离心收获CIK细胞，并通过苔盼兰计数； 第5天以3 X 16细胞/ml CIK细胞加入到六孔培养板，每孔为2ml，于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养过夜;第6天将20μ1 1Ε+7 TU/ml重组SP-(TCBP)n-L-Fc慢病毒加入到人CIK的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37 °C、5 %CO2的培养箱中孵育8_12个小时后，更换完全培养液RPMI 16404ml，所述完全培养液含10-2000IU/ml IL-2和10%自体血清；当CIK细胞生长密度达到6 X 16细胞/ml时，转入75cm2培养瓶中生长，6孔对应I个培养瓶，补充完全培养液RPMI 1640到50ml培养体系；于37°C、含5%⑶2培养箱内培养到第15-21天，期间根据CIK细胞密度和培养基颜色变化补充含10-2000IU/ml IL-2和10%自体血清新鲜完全培养液RPMI1640，并扩瓶到175cm2培养瓶中或转移到1.5L培养袋中生长； 培养到第21天的CIK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了 SP-(TCBP)n-L-Fc病毒载体的CIKs其表达SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未转染的CIKs为100倍以上;蛋白印迹技术检测其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表达水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒转染的CIKs培养上清中其灰度高于2000以上。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得细胞因子诱导杀伤细胞，增殖倍数达1000倍以上，培养到21天细胞因子诱导杀伤细胞数达3 X 19以上。7.—种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 一，重组SP-(TCBP)2-L-Fc基因构建及其慢病毒的制备 新的多肽-可结晶片段域重组基因由干扰素γ信号肽、两个肿瘤细胞结合多肽和可结晶片段域重链的第2和3恒定区基因片段构成，可结晶片段域重链的第2和3恒定区片段，第24个丝氨酸突变为天冬氨酸和第117个异亮氨酸突变为谷氨酸，S卩Fc-D/E; 将人IFNy-SP、2个TCBP和Fc-D/E基因序列通过化学合成获得，在两个TCBP之间以及TCBP和Fc-D/E之间均引入连接多肽，其基因序列为GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFNγ -SP、( TCBP) 2和Fc-D/E的 cDNA，即 SP- (TCBP) 2-L-Fc ； 将SP-(TCBP)2-L-Fc的目的DNA片段和pUC229载体Hind 111/^1111!11双酶切后，在了40嫩连接酶作用下，将两者于4°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合SP-(TCBP)2-L-Fc大小和序列后，将测序正确的菌液转接于1ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37 °C培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80 °C超低温冰箱中长期保存;所述SP-(TCBP) 2-L-Fc大小为858bp; 将SP-(TCBP)2-L-Fc的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体Hind III/BamH I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定； 取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个1cm的培养皿6X 16个细胞数接种于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜;第二天转染前移去培养液，换5ml Opt1-MEM培养液;取9yg包装混合液和3yg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opt1-MEM中，混匀，取36μ1 I ipof ectamine2000加入1.5ml Opt1-ΜΕΜ中，混匀，室温放置5min ；混合质粒溶液和Iipofectamine 2000稀释液，置室温20min ；混合液滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37 °C、5 %CO2细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入1ml的PBS液清洗一次，晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃;加入含10%血清的细胞培养基20ml，于37 °C、含5% CO2培养箱内继续培养72h; 根据细胞状态，收集转染后48h的293FT细胞上清液;于4°C，4000g离心1min，除去细胞碎片；以0.45μπι滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4°C;离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心lOOOOrpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分装，保存于-80 °C超低温冰箱，即制备成了SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒； 二，介导抗体依赖性细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备 分别采集晚期前列腺癌和乳腺癌患者30ml自体外周血，加入等量I XPBS稀释，沿离心管管壁叠加于淋巴细胞分离液上，形成明显界面，室温下2000rpm离心20min，吸取界面层的PBMC，用I X PBS洗涤两次；苔盘兰计数后，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到3 X 16细胞/ml，并补充1000活性单位(IU)/ml IFN-γ和10%自体血清，每20ml加入到75cm2培养瓶中，于37°C、含5%CO2培养箱内培养24h； 24小时后加入50ng/ml IL-15、50ng/ml IL-18,20ng/ml鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和500IU/ml IL-2，于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养2天;第3天补充含50ng/ml IL-15、50ng/ml IL-18，20ng/ml 0KT3和500IU/ml IL-2和 10% 自体血清的RPMI 1640培养基，继续培养到第5天;第5天离心收获CIK细胞，并通过苔盼兰计数； 第5天以3 X 16细胞/ml CIK细胞加入到六孔培养板，每孔为2ml，于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养过夜;第6天将20μ1 lE+7TU/ml重组SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒加入到人CIK的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37 °C、5 %CO2的培养箱中孵育8_12个小时后，更换完全培养液RPMI 16404ml;所述完全培养液优选含500IU/ml IL-2和10%自体血清；当CIK细胞生长密度达到6 X 16细胞/ml时，转入75cm2培养瓶中生长，6孔对应I个培养瓶，补充完全培养液RPMI 1640到50ml培养体系;于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养到第21天，期间根据CIK细胞密度和培养基颜色变化补充含500IU/ml IL-2和10%自体血清新鲜完全培养液RPMI 1640，并扩瓶到17 5 c m2培养瓶中或转移到1.5 L培养袋中生长；转染晚期前列腺癌患者CIK的S P -(TCBP)2-L-Fc慢病毒中TCBP为与前列腺特异抗原特异结合的多肽基因序列，转染晚期乳腺癌患者CIK的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒中的为与乳腺癌人表皮生长因子受体-2特异结合的多妝基因序列； 测试SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞后培养到21天后其的表达水平;在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，培养到第21天的CIK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了SP-(TCBP)2-L-Fc病毒转染晚期前列腺癌和乳腺癌患者的CIKs其表达SP-(TCBP)2-L-Fc基因分别高于未转染的CIKs为125.1和112.34倍； 三，介导抗体依赖性细胞毒性的CIK细胞蛋白印迹和流式细胞检测 取步骤二制备的晚期前列腺癌、乳腺癌患者和正常健康人来源第15天培养获得的CIK细胞进行测试;蛋白印迹技术检测SP- (TCBP) 2-L-Fc融合蛋白在SP- (TCBP) 2_L_Fc慢病毒转染晚期前列腺癌和乳腺癌患者来源CIK细胞中培养上清，SP-(TCBP)2-L-Fc融合蛋白大肠杆菌中表达水平以及未转染的晚期前列腺癌和乳腺癌患者来源CIK，灰度分析结果显示SP-(TCBP)2-L-Fc灰度值的分别为 2226、2036、2731、0和 282; 步骤二制备的前列腺癌患者SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞流式细胞检测，该CIK细胞⑶3和⑶56双阳性率为43.79%，⑶16阳性率为37.39% ;其中⑶3阳性率为95.98%； 步骤二制备的乳腺癌患者和正常人SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒转染CIK细胞CD3和⑶56双阳性率均超过40%以上，CD16阳性率超过30%以上；而未转染的CIK细胞⑶3和⑶56双阳性率均在20%左右，⑶16阳性率低于10%以下。8.—种制备介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (1)获得权利要求1-7任一项所述的稳定表达SP-(TCBP)n-L-Fc的病毒载体； (2)CIK细胞因子，包括IFN-γ、IL-15、IL-18、鼠抗人抗CD3单抗(0KT3)和IL-2; (3)淋巴细胞培养基，包括RPMI1640和无血清培养基； (4)淋巴细胞分离液； (5)生理盐水； (6)使用说明书； 其中，所述使用说明书包括权利要求1-8中任一项所述的方法。9.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞因子诱导杀伤细胞的应用。
【文档编号】C12N15/62GK105907789SQ201610141302
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年3月14日
【发明人】陈建勋, 黄启明
【申请人】紫程瑞生会(北京)生物技术发展有限公司